一起学NGS数据分析之基因位点注释

    在通过各种方式去除低质量的位点以及不符合遗传模式的位点后，下一步就是要对这些位点进行注释，比如说这个变异位点是在外显子上吗？有没有改变氨基酸啊？在千人基因组数据库中的频率怎么样啊？今天我们就来介绍一下Annovar软件的使用。这个软件非常容易上手，在这里游侠主要介绍两种方式：

第一种

      第一种是网站的方式，非常方便简单，不需要任何生物信息学技能，具体操作如下：

1.       Bing搜索wAnnovar，打开第一个搜索结果，或者直接在浏览器里输入http://wannovar.usc.edu/；

2.       在email里输入自己的邮箱地址，在Sample Identifier输入样本名称；

3.       点击Iuput File选择自己的vcf文件

4.       过几分钟后就可以点击链接地址，看到TXT file右击另存为，保存在本地电脑上。

第二种

     第二种方式是在本地（linux操作系统）安装annovar软件，下载相应的多个数据库，具体操作如下：

1.       Bing搜索Annovar，打开第一个搜索结果，或者直接在浏览器里输入http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/；

2.       注册账户，填写教育网邮箱；

3.       根据邮箱里的链接下载最新版annovar软件，下载后无需安装，直接使用；

4.       下载annovar网站相应的数据库，命令如下：./annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb  -webfrom annovar dbnsfp30a humandb/hg19；常用数据库都需要下载，总大小在二三十G左右；

5.   现在就可以使用annovar注释vcf文件了，table_annovar.pl test.vcf /humandb/hg19/ -buildver hg19 -out test -remove -protocol refGene,genomicSuperDups,phastConsElements46way,esp6500siv2_all,exac03,1000g2014oct_all,avsnp142,clinvar_20140929,scsnv,cosmic68wgs,ljb26_all -operation g,r,r,f,f,f,f,f,f,f,f,f -nastring . –vcfinput

各数据库解释

    Annovar输出的结果是可以在EXCEL或Calc（linux下的EXCEL）中打开的，简单介绍一下每一列的大体意思。

Chr：变异位点所在染色体编号

Start：变异位点开始位置

End：变异位点终止位置，对于SNP来说start与end位置是相同的；

Ref：参考基因组碱基

Alt：检测样本变异碱基

Func.refGene: 变异位点所在功能区，主要有外显子区、内含子区、剪切位点区、启动子区、UTR区，基因间区等；

Gene.refGene：变异位点所在基因名称；

GeneDetail.refGene：变异位点具体名称，如NM_001160184:c.*518G>A,NM_032129:c.*518G>A；

ExonicFunc.refGene：外显子区功能改变，主要有错义突变、同义突变、无义突变、缺失移码突变、插入移码突变、缺失非移码突变、插入非移码突变等；

AAChange.refGene：氨基酸改变，如AGRN:NM_198576:exon9:c.G1660A:p.V554M；

genomicSuperDups：变异位点是否位于基因组重复区，如果是则有Score=0.977993;Name=chr8:240489类似提示，则变异位点可能为假阳性，筛选位点需慎重，如果不是，则提示为0或点号；

phastConsElements46way：变异位点保守性，如果处于保守区则突变致病的可能性比较大，不保守提示为0或点号，保守则显示分值；

下面几列为变异位点在数据库中的频率，如esp6500代表6500人的外显子数据库，ExAC为65000人的外显子数据库，ExAC_EAS为东亚人群的ExAC数据库，1000g2014oct_all为千人基因组数据库，需要提示的是内含子的变异要看千人基因组数据库，其他2个数据库没有内含子变异信息；

avsnp142：变异位点在dpSNP数据中的命名，如rs28561399；

clinvar_20140929：变异位点在NCBI网站clinvar数据库中的记录，这对于寻找遗传病致病位点非常重要，如果有经济实力的机构最好购买HGMD专业版数据库；

再下面几列表示各种软件预测变异位点的致病危害性，如avsift，Polyphen2，LRT，MutationTaster，FATHMM，RadialSVM，LR等，D代表有害，T,B,P等可以容忍，整体上来说，目前的预测软件还不够特异，希望人工智能能够在这一块有所突破，游侠推荐RadialSVM软件预测结果，经实例验证比较靠谱，其他比较靠谱的预测软件还有Alumut，不过是商业化的需要收费；

再下面几列也是标注位点保守性的，一般不常用，

最后会有样本检测的基因分型信息，如0/1:76,76:152:99:1754,0,1839，0/1表示为杂合子，1/1代表纯合子，76,76分别代表野生型位点的reads数与突变型位点的reads数，152代表覆盖该变异位点的总reads，也就是depth测序深度，99代表基因分型的可信度，1754,0,1839表示具体的分型数值。

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