前言
Alport综合征（ATS）是一种临床异质性很高的肾病，占发展至终末期肾脏疾病（ESRD）患者的0.3%-2.3%。ATS是由编码alpha 3-4-5 异源三体的IV型胶原蛋白基因突变导致，IV型胶原蛋白基因可由足细胞产生，为成熟肾小球基底膜（GBM）的主要成分。
在ATS中，未能将非成熟的IV型胶原蛋白（alpha 1-2-1链）替换为成熟的alpha 3-4-5链会导致渐进的肾脏损伤，最终导致终末期肾脏疾病，并且与肾小球硬化，肾小管间质纤维化和炎症，以及细胞外基质重组相关联。具体的超微GBM病变包括致密层的无规律变薄，大面积增厚及分裂。患者经常显示其他的肾脏外的表现，比如双耳高音感觉神经性听力丧失和不明原因的视觉损伤。
ATS已有三种孟德尔遗传模式被报道：COL4A5突变导致的半显性X连锁（XLAS），位于2号染色体上COL4A3或COL4A4基因突变导致的常染色体隐性（ARAS）和常染色体显性（ADAS）。占大多数情况的X连锁半显性，临床特征为持续血尿，蛋白尿，不可避免的发展至ESRD（在20岁到30岁尤为典型），男性伴高发性听力丧失和视觉异常，女性通常只表现出泌尿系统异常，但一小部分会发展为ESRD。在常染色体隐性，临床和表型特征与XLAS男性患者中所观察到的一致。常染色体显性严重程度更轻，很少与肾脏外表现关联，但是有一部分患者（29%）在人生后期进展为肾衰竭（平均年龄56岁）。然而甚至在同一家系中，ATS患者的临床表现差异很大，暗示了更复杂的遗传模式的可能性。
通过几个欧洲中心的合作和使用高通量测序，我们最近已经证明ATS存在双基因遗传（DI）：alpha 3-4-5 IV型胶原蛋白基因中存在两个不同基因的突变。双基因遗传的定义为“通过两个基因位点的组成的基因型能够比一个基因位点组成的基因型相对更清楚地解释部分患者和他们未患病（影响程度更轻）的亲属的表型”。尽管双基因遗传在几种疾病中被描述过，比如视网膜色素变性，耳聋，和Bardet-Biedl综合征，但其作用在疾病发病机理中一直有争论。所以，随着能同时检测几个基因的二代测序方法的出现，双基因遗传才能被建立为几种疾病的共同模式，而不是个例。最近，一个叫做DIDA（双基因遗传病数据库）的数据库被建立，首次系统收集了涉及到双基因疾病的关于基因和遗传变异体的详细信息。
有趣的是，这个“双基因模型”能比单基因遗传更好地解释ATS疾病中高度可变的临床表型。初步结果认为在两个不同的IV型胶原蛋白基因的杂合突变的患者比X连锁或常染色体隐性Alport综合征更晚发展为肾衰竭。
这里，通过二代测序（NGS），RNA研究，和临床再评估的方法，我们在一组新的Alport患者家系中发现了双基因遗传，这些结果强调了在一些家系中重新考虑Alport综合征的遗传模式的重要性，并帮助解释基因型-表现型相关性，为正确评估复发风险和预后考量的准确基因咨询提供基础。
材料与研究方法
患者和家系
患者由意大利ATS遗传诊断研究所Siena遗传医学部的肾病学家和/或临床遗传学家所选。
Panel设计
为在表现出临床疑似ATS的患者中执行基因检测，利用“Ion AmpliSeq? designer”软件为COL4A3，COL4A4，COL4A5定制Panel。我们把编码区和所有侧翼的25bp及以下的内含子作为目标。3’和5’ 非编码区不包含在自定义面板内。三个基因在自定义面板中的总覆盖率为98.33%，并且由两个不同的，包含98和96个扩增子，共184扩增子的PCR引物库组成。
Sanger测序和分离分析
通过直接Sanger测序，所有可获得的家系成员的DNA进行家系分离实验。测序在ABI Prism 310 遗传分析仪下进行，数据通过Sequencher software V.4.9被分析出来。
结果
在本研究中，利用NGS，我们鉴别出了带有两个不同的IV型胶原蛋白基因突变的四个ATS家系（双基因模型）。在三个患者中（家系1，2，4的先证者），我们发现在COL4A3和COL4A4两种基因突变的组合，然而在剩下的一个家系中（家系3的先证者），我们鉴别出了COL4A5和COL4A3突变的相关性。使用Sanger测序，突变被验证，并且分离分析在所有可获得的家系成员中被进行。我们还鉴别出一个（家系5）在标准GT-AG剪接位点共有序列外的两个IV型胶原蛋白基因的内含子变异体暗示了双基因遗传：c.976-56A>G in COL4A4 and c.780+5G>A in COL4A5。根据软件预测，c.976-56A>G在 COL4A4的改变创造了一个替代的5’剪接位点，即使五个程序中四个预测c.780+5G>A 在COL4A5的变异体会有5’标准剪接位点的衰减，这些变异没有在数据库中报导。
家系介绍
突变在相同染色体上的双基因常染色体遗传
在两个COL4A3/COL4A4组合突变的家系中（1和2），两个突变为顺式构型，并从同一染色体上遗传。在这些例子中，遗传模式模仿了一个复发风险为50%的常染色体显性遗传。然而，相比于常染色体显性模式，临床表现更加严重。因此，在家系1和2中，III:1和II:2分别在52和34岁逐渐发展为终末期肾病。
双基因非连锁常染色体和X连锁遗传
在家系3的先证者（II:1）中，我们在COL4A5检测到一个新发突变，与在COL4A3基因上遗传自父亲的变异形成组合。女性患者表现出一个非典型的与年龄有关的（8岁）严重的临床症状，包括血尿和蛋白尿。而只携带一个COL4A3突变的父亲（I1；44岁）和妹妹（II:2；7岁）都无症状。
突变在不同染色体上的双基因常染色体遗传
在家系4中，在COL4A3和COL4A4的两个突变是独立遗传的，很可能为反式构型。这种遗传方式模仿了有25%患病概率的常染色体隐性遗传。然而，这种组合的临床严重程度介于常染色体显性和常染色体隐性之间。携带两个杂合突变的先证者（II:1）在40岁表现出CRF并在49岁表现出ESRD，而在COL4A4上只携带一个突变的47岁的弟弟（II:2）表现出正常肾功能的镜下血尿和蛋白尿。
亚效等位基因剪接突变造成单基因X连锁遗传
在家系5中，在生物信息剪接工具的基础上，我们假设一个在COL4A4和COL4A5中涉及内含子突变组合的双基因遗传模式。然而，微基因试验演示出COL4A4变异体不影响剪接，COL4A5变异代表一个“泄露”剪接突变。所以这是个亚效等位基因导致的X连锁遗传。8岁并有两个变异的先证者（IV:1）表现出单独的血尿。而携带COL4A4的良性变异的父亲（III:1）和携带COL4A5的亚效等位基因变异的母亲（III:3）都是健康的。在母系分支中，我们观察到3个被影响的男性患者，2个分别在33岁和48岁表现出听觉减退和ESRD。另一个男性对象（III:5），在23岁患有血尿，蛋白尿和双眼圆锥形角膜。在母系，我们还观察到两个女性患者，一个在70岁开始发病ESRD并卒于76岁（I:1），一个目前52岁患有牵扯性听觉减退（II:5）
讨论
在2015，通过几个欧洲中心的国际性合作努力，我们记录了双基因遗传在Alport综合征中的出现。在当今的研究中，通过高通量测序可以同时分析COL4A3，COL4A4和COL4A5基因，为Alport综合征可以通过超越单基因模式的遗传模式遗传提供了进一步的证据，解释了发病年龄和临床表现。虽然第一个组合已经被报道过，第二个观察是第一次被描述。这个证据核实了所有突变IV型胶原蛋白基因的组合都有可能与3个α分子在三链螺旋的形成中的平等互动相吻合，并且表明多变的临床表达性可能与变异的缺陷性COL4三链螺旋组合的数量和残基的机能活动有关。
本研究展示了四个双基因遗传的新家系的研究，有助于描述相关的表现型并强化了临床医生考虑更复杂的遗传模式去更好的评估正确的复发风险和明确预后的重要性。总的来说，与先前的研究相吻合，与单突变患者相比，两个不同胶原蛋白基因突变的患者表现出更严重的表现型。在双杂合患者中，ESRD的平均发病年龄为45岁，与先前报道的数据相吻合。
最后，这个研究为ATS中的双基因遗传提供了深层证据并强调了在临床评估中考虑这些遗传模式的重要性。的确，与单基因遗传模式相比，这种遗传模式可以解释疾病多变的临床差异。通过NGS对非典型遗传的病例鉴别是至关重要的，因为它促使重新考虑家族的复发风险，并为ATS遗传和产前咨询的管理提供了新视角。
本文翻译节选自Clin Genet. 2017 Jul;92(1):34-44.（pmid：27859054）
译者介绍
黄怀志，本科大四，就读于加州大学洛杉矶分校（UCLA）。主修生理科学，辅修神经科学。
研究兴趣：脊椎动物视网膜细胞的发育与疾病；神经分化与视网膜变性中神经元存活的信号机制；以及运动医学方向
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