各位科研界的小伙伴们，大噶好。小编先给大家讲个故事，英国有这样一对可爱的同卵双胞胎小姐妹——奥利维亚和伊莎贝拉，长得几乎一毛一样，但健康状况却截然不同。2005年7月，可怜的宝贝奥利维亚患上急性白血病，而伊莎贝拉身体却没有任何异样。后来奥利维亚在医生掰掰的精心治疗下完全康复，全家人欢天喜地，却独留医生们在科研的狂风暴雨中徘徊多年，怪我咯！？医生们非常困惑，同卵双胞胎拥有几乎完全一样的遗传信息，为甚么一个患病另一个完全正常腻？后来 ，人们才知道原来是“表观遗传修饰”在作怪。
某度显示，表观遗传学指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，主要包括组蛋白修饰、转录因子调控、DNA甲基化、基因沉默、RNA编辑等。简单来说，就是——环境也可以改变基因。那么小伙伴们可能会问，什么样的环境因子会导致生命机体改变呢？发生这些变化的原因又是啥呢？别急，小编这就教你如何利用高科技武器（高通量测序技术），逐个击破我们对表观遗传修饰的困惑。本期，我们先修炼修炼高IF文章（转录因子调控类）不可或缺的ChIP-seq吧！
ChIP-seq修炼秘籍
该秘籍一共分为七重，帮助您从ChIP-seq小白，修炼成ChIP-seq大白，开个玩笑。好啦，让我们操练起来吧！
第一重：ChIP-seq是个神马鬼？
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunopre-cipitation，ChIP），在生理状态下把细胞内的 DNA 与蛋白质交联在一起，通过超声处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的 DNA 片段。ChIP-seq，顾名思义，就是将ChIP富集到与蛋白结合的DNA片段进行高通量测序啦。
ChIP-seq实验流程
第二重：ChIP-seq究竟有啥用？
ChIP-seq可用来分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化等。该方法可以应用到任何基因组序列已知的物种，能确切得到每一个片段的序列信息，并可基于多个样品进行差异比较分析。具体的分析可见下图：
第三重：ChIP-seq怎么设计实验对照？
想要搞懂这个问题，我们要先明确几个概念：
1）input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，判断ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP 组和 input 组亮度差不多，说明 ChIP 效率高，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之，说明效率低，实验条件有待改进）
2）阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带。（个人认为这组最理想的结果当然是没有条带，但是如果有一条淡淡的条带，也无妨）。
3）阳性对照：一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因（当然是在该细胞中表达的基因，所以为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带，也用于判断ChIP的效率。
一般情况下，我们建议ChIP-seq至少要对input组和实验组进行测序。
第四重：ChIP-seq基础概念扫盲
要想看懂ChIP-seq文献，以下几个概念您可必须要知道哈。
峰(peak)
a) 定义：由于超声打断的随机性，所以包含某个位的超声片段可能有多条，相互间起止点不同，这些片段被富集，片段间的重叠区域称为“峰”，即DNA与蛋白相互结合的位点。为了剔除假阳性，以没有经过免疫沉淀的超声样品作为负对照。
b) 峰型：不同的DNA结合蛋白在基因组上的分布模式是不同的，具体体现于ChIP-seq峰形的不同
转录因子的峰型：尖锐状（sharp peak，即信号高度集中）
组蛋白标记的峰型：连绵状（broad peak，信号跨越一定范围），
RNA聚合酶II峰型：上述两者兼有
c) 搜峰软件：MACS、Peak Finder、Cis Genome、SICER
peak关联基因
a) peak与受调控基因的对应：调控因子不仅以线性方式调控临近基因，还可以调控距离较远，甚至是不同染色体上的基因，目前大多软件搜索的是以线性方式调控的临近基因。
b) 搜峰软件：Peak Analyzer、Peak Annotator 、Peak Splitter
Motif （转录因子）
1）TFBSs (Transcription factor binding sites)
转录因子结合位点通常是指基因组上，供转录因子结合的5-14bp的DNA序列
2）motif
转录因子与被调控基因是多对多的关系，一个转录因子可以识别相似的TFBSs ，这些TFBSs通常可以一个module表示，即motif
3）cis-regulatory module (CRM)
真核生物中，多个TFBSs往往集中于一段短DNA序列 (长度一般不超过200pb)中，该序列称为CRM
第五重：修炼成功典范
哥哥和弟弟是双胞胎，但是哥哥好像比弟弟胖一些，为虾米？答案在此。我们进餐后，消化系统就会快马加鞭的消化食物，维持我们正常需要，但是消化能力也是因人而异的呢。下面就以肝脏代谢脂类为例，解释表观遗传的强大作用。胆汁酸是胆汁的重要组成部分，与脂质代谢密切相关。在Genome Research上发表的文献里，主要介绍了一种纤维细胞生长功能因子FGF-19可以导致甾醇生物合成过程沉默。
首先，FGF--19和Veh处理小鼠肝脏，ChIP-seq寻找SHP的潜在靶基因，得到共同富集和不同富集的峰信号（a）。但有意思的是无论FGF-19还是对照处理，这些峰信号大部分都临近启动子区，也就是说SHP对转录因子的临近启动子区具有偏好性（b、c）。
图1 不同处理下SHP结合区域统计
既然这些峰信号都临近启动子区，而转录因子一般都是位于启动子区的，是否这些基因与转录因子存在功能相关还是仅仅是巧合呢？基因GO富集分析，发现大部分与代谢通路相关，同时与已知转录因子存在功能相关性。
已知SREBP-2是甾醇合成中主要转录激活因子，而SHP和SREBP-2也存在交集（a），那么是否SHP也参与甾醇合成呢？通过ChIP-seq发现这些转录因子确实会在FGF19处理后富集（b），同时转录水平和蛋白水平也证明SHP可以调控甾醇合成（c、e）。
SHP和SREBP-2都可以调控甾醇合成，那他们是否可以通过某种联系共同调控甾醇的合成呢？研究表明SHP和SREBP-2确实存在功能相关性。FGF19处理小鼠肝脏后，增强SHP与SREBP-2功能联系从而导致甾醇合成及运输过程沉默。
小结：本文通过ChIP-seq技术，得出FGF19可以调控胆汁酸合成和进餐过程，很适合研究表观遗传的童鞋仔细研读呢。
参考文献：Young C K, Sangwon B, Yang Z, et al. Liver ChIP-seq analysis in FGF19-treated mice reveals SHP as a global transcriptional partner of SREBP-2. Genome Biology, (2015) |DOI: 10.1186/s13059-015-0835-6
第六重：测序前需知
样品类型：ChIP之后的DNA
样本要求：浓度 ≥5 ng/μl（TBS-380），总量≥100ng
推荐测序量（基因组大小，结合位点多少）：
10M ~ 20M reads：转录因子的DNA结合位点和基因组与组蛋白修饰相关的位点通常落在特定的、狭窄的区域（6~20 bp），位点的个数大约有1万左右
60M reads：蛋白与DNA有更多的结合位点（比如 RNA Pol II）或者结合的位点比较宽（比如大部分的组蛋白修饰）
项目周期：45天
第七重：活学活用
美吉愿与您联手，组您在ChIP-seq的路上越走越远！期待您的成果展示呦！
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