干货整理 | 转录组测序和分析，你需要知道的

转录组测序及分析技术可以解决新基因的深度发掘、低丰度转录本的发现、转录图谱绘制、可变剪接的调控、代谢途径确定、基因家族鉴定及进化分析等各方面的问题；成为了广大科研工作者备受青睐的高通量测序技术之一。

转录组研究的应用领域十分广泛，适合研究组织特异性的、不同生长发育的、逆境胁迫下的、侵染转基因的、性状突变等材料。

转录组是在某一特定发育时期或某一生理条件下，细胞或组织内所有转录产物的集合，包括mRNA、lncRNA、small RNA、circle RNA等。因此做转录组测序理论上可以研究各种长度范围的RNA序列，目前的常规技术包括mRNA测序、lncRNA测序、smallRNA测序。

那么问题来了，研究转录组如何下手？

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根据研究对象，选择相应的建库策略

（1）mRNA：可以通过富集polyA的方式来调取mRNA，进行建库测序；

（2）lncRNA或lncRNA+mRNA：可以通过去rRNA试剂盒去除rRNA后进行建库测序；

（3）circle RNA：可以通过消化线性RNA，再去除rRNA后进行建库测序；

（4）small RNA：采用sRNA的建库策略，对18-40nt范围的sRNA进行切胶富集后建库测序。

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根据研究目的，选择不同的测序策略

（1）了解不同样品间基因或sRNA的表达差异：选择SE（single end）测序即可，测序量10M reads以上；

（2）进行基因的可变剪切、挖掘新基因、对现有基因的注释进行优化、检测基因融合等结构方面的分析：选择PE（pair end）测序，测序量则根据物种基因集合的大小来决定。

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基于转录组测序的主流研究手段

（1）RNA-seq denovo：基于序列组装，用于从头构建某物种的转录本序列；

（2）RNA-seq resequencing：对于已有参考基因的物种，进行基因定量、基因可变剪切、基因融合、新基因检测等分析；

（3）lncRNA-sequencing：主要研究lncRNA的表达量，预测新的lncRNA及其功能；

（4）sRNA sequencing：主要研究和分析small RNA序列，特别是miRNA的表达情况，并预测novel miRNA，miRNA靶基因分析等。

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有参转录组的分析流程&分析内容

分析流程（点击可查看大图）

（1）数据质控：如果clean data 比例过低则测序不合格。

（2）比对统计：如果与基因组、基因集比对率过低则可能因为：①样本污染严重，导致测序混入其它物种序列；②提供的数据库组装和注释结果较差或是近源种差异过大，导致比对率偏低。

（3）定量和差异分析：样本比对可以是单样本比对，也可以是组建比对。

（4）GO富集分析：纵坐标为富集的GO Term，横坐标为该GO Term中差异基因个数。不同颜色用来区分生物过程、细胞组分和分子功能，带*为显著富集的GO Term图。

（5）Pathway富集分析：纵坐标表示Pathway条目，横坐标表示Rich factor；点表示显著差异表达基因数，点的大小表示显著差异表达的基因数目越多。不同颜色的点表示不同的Qvalue值。

（6）聚类分析

（7）新转录本预测：第1列为转录本ID；第二列为Gene ID；第三列为转录本所在的染色体；第四列为转录本所在染色体的链信息；第五列为转录本的外显子数目；第六列为每个外显子的大小（多个用逗号分隔）；第八列为该转录本在所用样品中的表达量值；最后两列分别为CNCI预测给出的分类（coding和non-coding）和CNCI预测给出的分值。

（8）AS分析：横坐标表示可变剪切事件，纵坐标表示基因数目或者可变剪切事件数目。每个样品代表一行。

（9）SNP分析

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无参转录组分析流程&分析内容

分析流程（点击可查看大图）

（1）组装结果统计

（2）组装完整性评估：组装完整性是衡量转录本组装结果好坏的重要指标。将组装得到的转录本与最近缘的物种CDS序列进行比对，从整体水平上来评估转录本组装的完整性。

A.横坐标表示转录本的覆盖深度，纵坐标表示与近缘物种同源基因的长度之比；B.横坐标表示同源基因序列的长度，纵坐标表示与近缘物种同源基因的长度之比。

（3）转录本注释

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lncRNA分析内容

lncRNA 指长度≥200nt 的非编码 RNA。哺乳动物基因组序列中约 5%-10%被稳定转录，其中蛋白质编码基因仅约占 1%，其余 4%-9%的序列都转录为ncRNA。近年来的研究表明，LncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，该研究已成为遗传研究热点。

（1）lncRNA筛选与鉴定

（2）cis作用靶基因预测：lncRNA的功能与其坐标临近的编码蛋白基因相关，于是将lncRNA基因临近的（上下游10k/100k）蛋白编码的基因找出进行功能富集分析，以推测lncRNA的主要功能。

（3）trans作用靶基因预测：lncRNA的功能与样品中共表达的编码蛋白基因相关，可以通过样本间lncRNA与蛋白编码基因的相关性分析或共表达分析来预测。

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miRNA分析流程&分析内容

Small RNA 测序技术则是借助第二代高通量测序技术，对某物种某组织在特定状态下的18-30 nt（或18-40 nt）的small RNA 进行高通量测序。继而通过数据库比对，对获得的smallRNA 序列进行分析、鉴定，将数百万条small RNA 序列分类成rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和miRNA等。

（1）样本长度统计

（2）差异分析

（3）靶基因预测

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