用qPCR验证RNA-Seq挑多少个基因合适？

做完RNA-Seq测序之后，往往会用QPCR来验证一下结果。

因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考，参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证，表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。

  一般需要验证基因的数目：20个左右

在验证时，往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况，遇到此类情况，因为这是正常现象（活久见）。原因可以查看我们之前的微信分享的文章（戳这里）。

 

一个事实，我们看到的很多SCI都有验证实验部分，并且文章中的结果居然都是很好！很多同学心里更加捉急，为嘛我的结果不符合预期，为嘛我的结果这么挫？！

其实呢也许作者验证了多个基因，结果选取了10个效果较好的，其他验证结果不好、与预期结果不符或者自己不能阐述清楚的部分基因则建议不在文章中呈现了。所以通常在文章中阐述了少数的几个，例如10个。

具体验证多少个基因就要看准备发表的杂志水平和要求了。一般的文章验证20个左右就足够了。在RNA-Seq实验中设计生物学重复的，如果重复样本间相关系数高，只需要验证你关心的基因就行了。下面我们列出一些文献中用QPCR验证RNA-Seq的截图，包括Mrna、miRNA、Lnc-RNA，不难看出，很多基因QPCR的结果与RNA-seq是有出入的，乃们感受下。

 

挑选基因的建议

下面介绍下挑选做验证的基因的一般建议：

 

• 首先，验证实验不只是为了验证而验证，最好还应该有生物学意义。

  所以不需要验证所有的基因，而是只需要验证个目标或者候选基因，把从这些基因差异中得到的结论说清楚，你就已经是叫兽了。建议可以先从GO和KEGG的聚类分析结果入手，看看里面跟你感兴趣的研究方向有关的基因是否存在差异。尤其KEGG是个强大数据库，从它的图上可以得到很多信息。

  
  

  总之，RNA-Seq的研究必须结合自己的研究方向，不可能全部信息都用上的，要能结合一个生物学特点或者研究机制进行深入的研究。

 

• 其次，是挑选基因的原则

1. 样本间表达差异倍数大（log2(FC)）；

2. 基因表达量高（至少在一个样品中的表达量RPKM/FPKM大于50）；

3. 基因测序深度readcount相对较高，如有些研究人员选择readcount大于20；

4. 基因长度。

这几条标准的指标目前没有统一固定的标准，需要研究人员根据自己的研究需要进行选择。

这只是最开始筛选基因的原则，等把基因找到了之后，也许这个基因设计不出来合适的引物，所以可以找到基因后还需要看看能不能按照实时定量引物设计原则设计出好的引物。

最后声明一点，用QPCR验证RNA-Seq结果，由于两种技术本身存在较大差异，所以建议仅关注两种基因表达的检测结果变化趋势是否一致，如上/下调变化趋势,而不是表达定量的值以及差异倍数（依然那句话，一定范围内的差异是不可避免的）！