王家雄 综述；史轶超，杨慎敏 审校
(南京医科大学附属苏州市立医院生殖遗传中心, 江苏苏州 215002）
【摘要】精子超微结构畸形往往与精子的活力、遗传物质完整性、受精潜能息息相关，而其观察离不开显微技术的不断变革。本文通过介绍精子形态学观察中显微技术的发展，并描述显微技术在精子各部位常见畸形以及凋亡生精细胞超微结构观察方面的应用，来阐述其在如今临床工作中的重要性。对于一些特殊的畸形精子症患者，在分析病因和采取辅助生殖手段之前，对其精子的超微结构进行分析是有必要的。
【关键词】精子形态；畸形精子症；超微结构 
世界范围内约有15%的夫妇存在着不孕不育问题，而其中男性的原因占20%~50%。很多情况下男性不育与精子畸形存在着一定的联系，临床上有些精子形态检测仅仅依靠光学显微镜观察无法彻底诠释与诊断，电子显微镜技术在畸形精子的超微结构研究中发挥了重要作用。对于临床常见的一些病症，如不动精子症，其病因可能是由于精子的超微结构异常造成，这时传统光镜观察显得乏力，而电镜观察却可以确定其病变特点以明确诊断。对于一些更为少见的系统性超微结构异常，如头尾分离精子、无头精子等，精准的超微结构分析可以协助判断病变的遗传基础。精子的超微结构不仅决定了精子的运动情况，也与辅助生殖结局息息相关，不同超微结构异常的患者辅助生殖结局存在差异，对特殊畸形在术前进行超微结构分析可以帮助预测辅助生殖的成功率，指导医生和患者做出治疗选择［1］。本文对精子形态观察中显微技术的发展与常见畸形的超微结构综述如下。
1 精子形态学观察技术
传统的精子形态观察由于光学显微镜分辨率的局限而无法区别一些相近的畸形精子，而且无法解释畸形精子的具体结构缺陷。电子显微镜相比光学显微镜，除了可以定性地检测精子内部极细微的异常，还可以直接从屏幕准确定量。尽管电子显微技术发明至今已有数十年，然而到目前为止，对精子超微结构的认识仍是基于传统电镜的观察。Chemes等［2］认为超微结构观察为一些特殊的畸形精子症的发生提供了结构基础，从而为之后的分子生物学分析和基因学研究打开了一扇大门。如今，透射电镜结合免疫胶体金技术而产生的免疫电镜，可以对精子膜表面上的各种受体和跨膜蛋白进行定位和初步的定量［3］。
在传统电子显微镜技术出现之后，光子扫描隧道显微镜(photon scanning tunneling microscope， PSTM)又逐渐发展起来，它具有纳米级三维分辨能力，成为光学显微镜的重大突破。以后，又陆续发展了一系列工作原理相似的新型显微技术，包括原子力显微镜(atomic force microscope， AM)、横向力显微镜(lateral force microscope， LFM)等。以往传统的电子显微镜技术需要将样本固定、脱水甚至包埋与切片，但是对于原子力显微镜，这种技术允许观察未受损精子的超微结构。此外，它可以让图像三维重建和增强对比度来观察细节，例如包围轴丝的精子中段线粒体［4］。在精子超微结构观察中，X射线显微镜的样品制备与常规光学显微镜一样，但分辨率能高达30 nm；在液体介质中观察，标本不需要固定、染色或金属涂覆，这些特点使X射线显微术成为有效的细胞尤其是细胞悬液的研究手段。Vorup-Jensen等［5］利用X射线显微术的这一优点，观察了精子获能过程中线粒体的超微结构变化。
一直以来，由于远场光学成像技术固有的衍射限制，导致可见光光学显微镜(包括普通荧光显微镜和共聚焦显微镜)的分辨率有限，随着高分辨率荧光染料和单分子光谱技术的不断推陈出新，高分辨率光学显微技术（high resolution light microscopy, HRLM）在细胞超微结构的观察和研究中得到了广泛应用。Chung等［6］利用HRLM在哺乳动物的精子中发现了钙通道蛋白CatSper，它定位在沿着精子鞭毛的4个线状信使分子的组织域内，是精子正常迁移功能所必须的蛋白。人工授精时，精子头部的空泡等细微异常会直接影响受精的成功与否，普通的光学显微方法无法达到观察要求，为了克服传统光镜的这个缺陷，Bartoov等［7］发明了活动精子细胞器形态学检查（motile sperm organelle morphology examination， MSOME)，精子DNA高度碎片化或者完全圆头精子症的患者，可以通过MSOME严格选择形态好的精子进行胞质内形态选择单精子注射（intracytoplasmic morphologically selected sperminjection， IMSI）,大大提高其辅助生殖的成功率。该技术不仅克服了传统精子质量评估方法，如扫描电镜、荧光原位杂交、精子染色质结构分析等在ICSI中无法同时进行的缺点，同时避免了在常规 ICSI 过程中对精子核细微形态学异常无法观察的不足。
2 超微结构显微技术在常见畸形精子观察中的应用
由于超微结构观察不仅在分辨率上优于传统光学显微镜，而且电脑科技的推陈出新也让电子显微镜可以进行定量观察。如今，超微结构观察不仅仅可以用于精子亚细胞结构的形态学评估，还可以对精子各部位畸形进行定量分析。
2.1 头部畸形 精子头部畸形是常规形态分析中最常见的类型，头部形状、空泡情况和顶体状态与妊娠结局息息相关。国外有研究表明，利用光学显微镜观察头部形态、顶体大小、顶体空泡状况并结合顶体反应实验，对体外受精(in vitro fertilization, IVF)的受精率有非常高的预测能力［8］，可见对精子头部形态的分析至关重要，而对于头部畸形的结构基础以及细微异常的观察非常依赖电子显微技术的参与。
2.1.1 圆头精子症 圆头精子症可以分为完全圆头精子症和部分圆头精子症，通过电子显微镜观察可以准确地对其进行细分。Alvarez Sedó等［9］通过超微结构研究圆头精子的发生过程，发现正常精子的早期顶体来源于高尔基体里初级顶体囊泡的融合，在这个阶段，核被膜与顶体接触的部分出现各种修饰，使顶体囊泡最后形成成熟顶体。而对于完全圆头精子症的精子，高尔基体初期衍生出小而非典型的多泡、多层结构，这些结构后期要么无法成熟，要么无法依附于核被膜而进入胞质残余体。与完全圆头精子症不同的是，部分圆头精子症的精子头部除了传统的圆形外，还存在很多椭圆形，伴随着核膜的异常与线粒体出现核内分布［10］。
2.1.2 头部空泡 精子头部空泡在正常男性精子中也会出现，但是当空泡过多的精子大量存在时就会伴随着患者精子质量下降和不育。Zhang等［11］在关于罕见的100%空泡精子的病例报道中提出，尽管光学显微镜可以应付常规的精子形态观察，然而对于精子空泡异常的观察，电子显微镜是一个十分有效的工具。Fekonja等［12］的研究发现很多空泡中都有着漩涡样的膜结构，而与以往的研究不同的是，他们认为现有的研究无法证明空泡是精子发生错误导致的，精子头部空泡可能是一个独立结构。
2.1.3 核异常 精子细胞核里包含的遗传信息对于精子的作用至关重要，上世纪人们意识到精子形态可以反映精子质量，但是光学显微镜无法看清精子细胞核的细微异常，而电子显微镜是精子核超微结构观察的有效工具。Skowronek等［13］研究了DNA损伤与精子核超微结构的关系，发现精子核内染色质超微结构与DNA损伤相关，大量染色质如果聚集在核膜附近有可能预示着精子的凋亡。Franco等［14］认为核区域的空泡也提示着染色质纤维的过早解聚，影响染色质的包装，并与DNA损伤有关，这会影响辅助生殖结局，所以他认为在对严重畸形精子症患者进行单精子注射之前，进行高分辨率的形态学筛选是必要的。
2.2 颈部畸形 颈部是头尾的连接处，也是精子动力的来源，颈部线粒体畸形会严重影响精子的运动。对于头尾连接异常的精子，IVF成功率极低，很多患者不得不采取ICSI。但是有研究表明，并非所有的精子头尾连接异常患者都可以通过ICSI成功受孕，正常中心粒的存在与否起到了决定性作用。由于传统的光学显微镜只能看清表观，而无法探究内在结构，所以超微结构观察对于颈部异常，尤其是头尾连接异常的诊断十分必要［15］。
2.2.1 颈部线粒体异常 在平时检验工作中，实验人员会发现很多精子颈部异常粗，但在光学显微镜下并不清楚其细微的结构。研究者在电子显微镜的帮助下，发现颈部异常粗的精子表现为颈部膨大、粗短，线粒体囊性扩张，微管消失［16］。Mundy等［17］的研究发现，弱精子症患者精子颈部线粒体明显少于正常对照，他们认为，颈部形成之前，线粒体被胞质包围，而后胞质脱离，线粒体迁移形成正常的颈部；而对于弱精子症患者，其精子线粒体有一部分可能随着胞质一起脱离，导致颈部线粒体数目异常。虽然精子颈部细胞器组装分配的机制还尚未了解，但是Olson等［18］的研究发现精子颈部线粒体与颈部特殊的细胞骨架结构之间存在桥状连接，这为解释精子颈部线粒体迁移组装提供了超微结构的证据。
2.2.2 头尾连接异常 精子的头尾连接异常包括很多现象，这些异常与精子颈部与尾部的细胞骨架有关。通过光学显微镜只能看到精子中段的表观异常，而通过电子显微镜观察可以发现，这些精子的中段不仅出现了插入角度异常、组装异常、线粒体排列异常，在一些特殊病例中精子甚至出现植入窝和基底板从细胞核中分离，头和尾之间的解离十分明显。Moretti等［19］认为通过超活体染色技术，利用透射电镜观察核膜完整性、顶体是否激活和精子染色质是否凝聚来确定精子的存活程度十分有效。
无头精子是头尾连接异常的一种特殊现象，通常认为其发病机制是精子头部的发育异常，与精子头部和颈部连接异常并无关系。然而通过对于无头精子的超微结构进行分析，Chemes等［20］发现患者的睾丸中也存在包含高尔基体的精子头部，之后头部与尾部的轴丝分别发育却并未连接在一起，精子星状体形成异常，引起了中心粒缺陷，最后导致了精子头部的脱离并最后消失。
2.3 尾部畸形 精子尾是负责精子运动的结构，严重的尾部畸形往往导致精子运动障碍，同时也会导致IVF的失败率升高。Malgorzata等［21］在IVF失败组精子中发现，其尾部超微结构畸形显著多于成功组，他们认为IVF失败的夫妇在采取ICSI之前，对男方精子进行系统性的透射电镜检查是有必要的。
尾部异常中的纤维鞘发育不良（dysplasia of the fibrous sheath， DFS），其精子会出现纤维鞘增生变厚，伴随着尾部环状结构的缺失，50%出现中心微管和动力蛋白臂的缺失［22］。我们实验室对短尾精子DFS进行了超微结构与基因检测，扫描电镜下清晰地观察到精子尾部畸形，部分精子尾部仅存末段样的结构；而在透射电镜下，可以见到精子尾部组装异常，精子纤维鞘以及线粒体等细胞器未能在正常的位置完成组装，而是紊乱地堆积在精子尾部；横断面可见精子纤维鞘明显增厚，大部分精子中心微管缺失；有的病例动力蛋白臂缺失，而有的却可观察到正常的动力蛋白臂［23-24］。虽然显微技术层出不穷，但是现在用于诊断DFS最可靠的形态学手段还是透射电镜。
精子尾部的外围微管上分布着成对的动力臂，而对于原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia， PCD)患者动力臂缺陷是最常见的病理改变,大约占 70%~80%，这导致精子尾部动力的严重不足［25］。PCD患者精子除了动力臂缺失之外，还有中心微管消失、放射辐异常、纤毛或鞭毛无中心管及轴系等结构异常，一般来说这些缺陷均可导致精子完全丧失运动能力。这些异常在光镜下难以发现，这是因为光学显微镜观察的都是精子尾部的表观，而利用透射电镜观察精子尾部横断面就可以清楚地看到中央轴丝的缺失、微管的排列异常以及动力臂的缺失［26］。
2.4 非特异性精子畸形 超微结构异常包括系统性的结构异常和非特异性结构异常，前者可由于遗传学异常引起，而后者往往由于多种后天性因素导致。非特异性精子畸形往往与患有特殊疾病和服用特殊药物有关，许龙根等［27］发现尿毒症患者的精子在电子显微镜下观察，畸形率大大高于光学显微镜观察，患者的精子在顶体存在病变的同时核内也出现大量空泡，伴随着部分精子的头尾分离与尾部多种畸形［27］。精索静脉曲张是男科临床常见的疾病，患者精子常出现狭长头部，这可能与该病症引起的回流压力有关。通过透射电镜观察，马华刚等［28］发现精索静脉曲张患者最常见的精子超微结构异常是在颈部存在胞质残余体，其中包裹了不规则环状排列的电子密度高低不等的物质，而精子头部多为锐角三角形，头部较长，连接段多发生分隔和异常。药物的作用也可以导致精子超微结构的变化，在治疗溃疡性结肠炎时，所用药物如柳氮磺胺吡啶，会导致精子出现巨大头部，停药后恢复，采用电子显微镜观察后发现药物引起的精子头部巨大化可能与精子核在药物作用后出现自发解聚有关［29］。
2.5 生精细胞凋亡 在不育患者的精液中，凋亡的生精细胞十分常见。导致生精细胞凋亡的因素是多种多样的，Sakallioglu等［30］研究发现，在烧伤的大鼠睾丸中，凋亡生精细胞增多，它们具有高电子密度的核结构，胞质中内质网体积变大，细胞外基质蛋白增多。Hussein等［31］发现经过X射线大剂量辐射后的小鼠睾丸中生精细胞出现凋亡的明显特征，出现了不规则的细胞核和密集的染色质聚集，电子致密的胞质被分裂于附近大量的凋亡小体中。除此之外，精索静脉曲张、隐睾、艾滋病甚至睾丸的恶性肿瘤等均可以引发生精细胞凋亡。印洪林等［32］发现生精细胞的凋亡是一个连续的过程，凋亡的生精细胞核会在核膜下或核膜间形成囊泡，随后核膜膨胀折叠并融合成花环状结构，最终形成凋亡小体和残余体，被组织细胞或粒细胞吞噬，他们认为对生精细胞的超微结构进行分析, 对生精细胞凋亡导致弱精子症的诊断和治疗具有重要价值。Sardi-Segovia等［33］利用透射电镜观察人类凋亡生精细胞的形态也发现了类似的现象，凋亡生精细胞中，核变形并伴随空泡化，染色质呈半月形且分散，而细胞质则表现出空泡化、胞质突起，出现嗜锇性板层小体，线粒体和内质网肿大，作者认为生精细胞凋亡的超微结构观察结合DNA碎片研究，可以来预测男性不育患者从少精子症到无精子症的过渡。
2.6 精子形态的定量检测 电子显微镜由于电脑技术的介入和超高的分辨率，使得其在定量分析方面也有十分突出的作用。早在上世纪定量超微形态学精子分析的长处就已被研究者们所认知，这种定量分析的方法结合扫描电镜和透射电镜，对精子7个重要部分（顶体、顶体后致密板、细胞核、颈部、轴丝、线粒体鞘和外层致密纤维）进行超微结构定量分析，并创建了一套评价体系，这种方法为特定的非标准体外干预治疗建立了一套标准，其中包括精索静脉曲张手术、FSH给药和针灸治疗等［34］。Pei等［35］对于受过针灸治疗的特发性不育症男性的精子进行超微结构观察并进行定量分析，发现通过针灸，患者精液中超微结构正常的精子显著增多，作者发现通过透射电镜可以准确测量精子超微结构的数据，并对正常结构进行计数，在这次实验中，针灸组较对照组精子顶体位置和形状、精子核的形状、轴丝的排列和形状以及附加纤维都更正常，然而对于一些特定病理的精子，如凋亡精子数量，针灸并没有改善。
3 结语
在临床，超微结构观察的应用已逐步引入，对于肾病的超微结构诊断在临床早已应用多年。而对于不育男性，尤其是无精子症患者的睾丸活检，超微结构观察也在逐渐弥补传统病理学观察的不足，为临床判断病因提供更多证据。如今，越来越多的科技手段可以帮我们更好地了解畸形精子的超微结构基础，结合分子生物学研究可以进行追根溯源的分析，来了解各种畸形精子症的发病机制和基因根源。我们认为在对一些特殊精子畸形进行诊断和进一步采取辅助生殖手段之前，进行超微结构分析或者进行形态学筛选十分必要。超微结构观察由于操作繁琐和成本偏高，在各个医院开展的并不多，下一步是如何让超微结构观察为临床诊断与治疗提供更为简便、可靠的依据。
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