生物样本库BS小组
摘要：
癌症基因组图谱的发展使胶质瘤研究的兴趣转向了肿瘤组织分析、患者诊断以及后续治疗决策的思考。既往研究强调单一依赖组织学，具有局限性，因那些结果会受到观察者间差异的影响。这样的研究发现组织学上相似的IV级脑肿瘤根据基因表达差异可以分为四种分子亚型，每种亚型表现出独特的基因组异常和临床结果。这些研究进展说明，现在的治疗策略必须考虑肿瘤组织中的分子信息，其目的是鉴别出最有可能从靶向治疗中获益的分子分层患者；同时，又可以使得非入组患者免于化疗副作用和昂贵的医疗支出。在推进临床阶段候选药物的研究过程中，脑肿瘤组织生物样本库的建立不仅需要获得具有临床病史和详细随访信息的肿瘤组织，而且需要高质量的独立于当前临床指标的已知能够预测患者生存情况的分子信息，如体细胞突变、转录于进一步研究，但同时需要患者的回顾性临床资料，以将动物体内实组和DNA甲基化谱等。此外，从这些肿瘤组织衍生的细胞系能够促进基于临床患者进行的异种移植小鼠模型的发展，在小鼠体内重建肿瘤可用验结果与临床数据相关联。这代表了精准医学的核心能力，其重点在于了解肿瘤间和肿瘤内的异质性，以便制定最佳的治疗方案，从而改善治疗效果。
关键词：胶质母细胞瘤；组织学；胶质瘤增殖细胞；癌症基因组图谱；肿瘤动物模型；心力衰竭；中风
缩写：
bFGF 碱性成纤维细胞生长因子
CMAP 连接图（是一个基因表达谱数据库）
CNS 中枢神经系统
EGF 表皮生长因子
GBM 多形性胶质母细胞瘤
GEMM 基因工程小鼠模型
GPCs 神经胶质瘤祖细胞
MRI 磁共振成像
NIH 国立卫生研究院
PDX 患者衍生的异种移植物
TCGA 癌症基因组计划
前言
胶质母细胞瘤（GBM）仍是预后最差的肿瘤。即使进行了手术干预、化疗和放疗, 通常患者的中位生存期也只有15个月[1]。替莫唑胺是胶质瘤临床治疗的标准用药，每年全球销售额为10亿美元，但也只能延长患者生存期3个月。该疾病的高侵袭性和高复发性是由于构成胶质母细胞瘤的细胞和分子具有异质性。最近基于分子的深入研究如癌症基因组图计划（TCGA）表明，病理结果相同的胶质母细胞瘤具有不同的分子特征，进一步表明其分子间的调节通路决定了每个肿瘤对靶向治疗方法的敏感性[2, 3]。尽管这些分子分析提示了基本的肿瘤抗性和复发的推测机制，但在临床前动物模型中尚缺乏生物学功能验证。在过去的十年中，通过研究证明使用商业性血清培养的胶质瘤细胞接种的小鼠异种移植肿瘤模型不能重现患者的原始肿瘤形态和转录组概况[4]。此外，这种体外连续传代的血清生长细胞通常含有在原发性肿瘤中未发现的基因组突变[5, 6]。事实上，被广泛使用的美国国家癌症研究所NCI-60人类癌细胞系，其初始目的在于建立一个患者新鲜标本来源的并标记有详细信息的肿瘤模型库，但通常在含血清培养基传代过程中很快发生了变化[7]。
从恶性脑肿瘤中分离出胶质瘤祖细胞（GPC），在补充生长因子的无血清培养基中以球状体结构的方式生长[8]。这种培养基组成与用于传代神经干细胞的培养基组成相似， 并有助于促进GPC的自我更新和成瘤性[9]。相比之下，添加血清可以促进GPC分化，导致细胞增殖停滞，随后肿瘤生长减慢。我们和其他研究者都已证明在这些细胞中核型标志物类似于原始肿瘤[6,10]。我们研发了通过机械研磨来传代这些球形细胞的方法，从而避免了各种酶溶液的不断使用。研究显示这些酶溶液可以改变以胚状体形式生长的人胚胎干细胞中的核型模式[11]。我们说的玻璃化法，是一种改编自体外受精程序的技术，该技术强调保留这些球体结构、减少含水量以防止解冻过程中受到冰晶体损害的重要性。总体来说, 这些方法保持了GPC的完整性和在小鼠体内建立异种移植（PDX）肿瘤的能力，真实地展现了原始肿瘤的病理生理学、细胞遗传学和转录组概况。这些指标反映了建立细胞系和胶质瘤样本库的重要性，保存这些细胞系和肿瘤组织库是临床最相关的资源，用于测试和验证从胶质瘤患者数据库中推测的结果。
建立临床相关的脑肿瘤资源是至关重要的，基于这些资源，我们可以讨论计算平台，如连通性图链接从体外和动物研究获得的多维临床信息，如患者年龄、肿瘤分级、分子信息、Karnofsky评分和磁共振成像（MRI）扫描[12]。这些计算的进步扩大了脑肿瘤可研究的范围[13-17]。重要的是, 我们的脑肿瘤生物样本库能够促进精确医学的研究，其中以患者为中心的生物学预测将会实现。
脑肿瘤资源
随着癌症基因组计划（TCGA）的进展, 已建立了几个含有低通量细胞系的脑肿瘤库，其重点是获得具有深层分子信息的临床病史（基因型-表型数据库）。这些肿瘤库建立的目标是促进精确重塑疾病研究的能力，以便基于患者信息可以测试计算预测能力[18]。生物样本库建造的核心包括我们之前展示的三个重要标准：
（1）患者来源的胶质瘤细胞在补充有生长因子的无血清培养基中生长
（2）使用玻璃化的方法进行冻存
（3）建立重现患者原始肿瘤病理生理学的原位PDX模型的能力
因此，以前的基因型-表型数据库仅需要简单的计算技术，包括与致病性相关的非常基本的数据字段；今后，这种方式将会发生改变，尤其是当我们希望能够提供真正的以精准医学为基础的发现，这种情况下，除了概率建模，还需要从机械角度建模，甚至需要更复杂的输入信息来源和使用工具记录结果。
GPC可以在补充有表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清条件下维持和繁殖，EGF和bFGF是经典的神经球培养物添加的细胞因子[19,20]。此外，Lee及其同事研究表明在无血清条件下生长的肿瘤干细胞样细胞非常接近地模拟其亲代肿瘤的基因型、转录组特征和形态特征[6]。因此，肿瘤神经球样本库的建立与保存肿瘤异质性的本质特征将会提供临床相关的资源来研究该疾病。这种方法还将允许我们进行相同的细胞系传代，以减少实验重复的变异性。由国立卫生研究院（NIH）牵头的路线图表征基因组学项目最近的研究结果指出，与原代组织中的类似细胞谱系进行比较时，体外培养细胞的表观遗传学被沉默，因此强调了冷冻保存低通道GPC来保留其分子表观遗传信息的重要性[21]。在许多涉及肿瘤繁殖细胞的预期分离的研究中，只有少量的临床材料可用，并且由于缺乏在方便的时间点保存这些细胞的适当方法而使这种限制复杂化。尽管GPC衍生的肿瘤在体内连续传代已被认为是保护细胞的最可靠方法，但实际上，获得适当老化的免疫缺陷小鼠并不总是行得通的[8]。我们开发机械研磨作为传代三维球体培养的方法，因为这种结构能够使神经球急性解离成单个细胞，从而延缓细胞衰老[9]。此外，细胞分化的诱导，例如通过添加血清，导致肿瘤生长的丧失和肿瘤消退[22]。
我们将玻璃化法用于体外受精胚胎的冷冻保存。玻璃化是玻璃状凝固的过程，通过快速冷却防止了水溶液的结晶[23]。这种方法已经普遍用于不同发育阶段的各种物种（例如鼠、兔、绵羊和牛）的冷冻保存[24-29]，人类和小鼠多细胞胚胎也已经使用这种方法成功冷冻保存[30]。该方法突显了冷冻保存细胞团块的可行性。此外，已经证明使用玻璃化法冻存的胚胎干细胞在解冻时能够保持其多能性、遗传学特征和细胞活力[31]。总的来说，玻璃化法可以提供以球形生长的脑肿瘤细胞的有效保存方法。虽然已经提出使用层粘连蛋白粘附GPC培养，但是这些生长条件可能会导致细胞转录组发生变化[32]。Dirks和同事通过对GPC球体培养物进行化学遗传学筛选，鉴定出了影响成人中枢神经系统（CNS）神经传递的小分子，表明临床上批准的神经调节剂可以重塑成熟的中枢神经系统并且能够在脑肿瘤的治疗中得到应用[33]。
为了便于测试患者分层方法和鉴定对疾病进展有作用的分子机制，研究者建立了基因组路线图来表征细胞、肿瘤异种移植和原发性肿瘤。建立患者来源细胞分子谱的关键目标在于对患者队列进行分层并考虑可接受的治疗策略。内容丰富的患者肿瘤分子谱需要进行系统地归档，以用于有效的数据挖掘和开展验证性研究。识别潜在的癌症特异性生物标志物的首要步骤是需要获得以患者为中心的生物信息学资料，该信息可用于样本库中的组织分析。在TCGA中，对参与的若干个组织库评估获得的样品的质量，结果发现，仅百分之一的样本对于下游分子数据的采集预测是可靠的[2, 34, 35]。样品质量和相关的临床信息是样本库的重要因素。我们的同事在以往的研究中已报导了在患者来源细胞的组织取样和培养以及保留原发性肿瘤的细胞遗传学和转录组学特征工作中实验人员具备相应专业知识的重要性[6, 10]。基于精准医学的研究，依赖于分子异质性，确保临床前小鼠模型能够代表病人的原始肿瘤病理生理学信息，从而有助于推进化疗候选药物进入临床试验。
由生物样本库建立的动物模型：信息性临床前小鼠模型
在动物中建立脑肿瘤模型揭示了促进肿瘤形成的遗传事件和分子机制。小鼠与人类具有广泛的分子和生理相似性，是研究肿瘤的有力工具[36]。与无脊椎动物模型系统不同，小鼠的肿瘤发展伴随着其他复杂过程，如血管生成和肿瘤转移，类似于人类癌症[37]。更重要的是，小鼠肿瘤模型提供了一个时间和基因可操控系统，便于研究致瘤过程，以及对特定治疗的反应性。
基因工程小鼠模型（GEMM）是研究肿瘤生物学的常用模型。使用GEMM有几个限制，因为肿瘤的发生往往需要多个驱动突变来启动[3, 39]。转基因的表达通常会升高到远高于患者的水平。在这个模型中出现的肿瘤通常是零星的，导致设计需要再现大量动物数据研究的困难。TCGA研究也已经证明，驱动突变谱在患者中显著不同，因此特定GEMM与疾病的相关性可能也是有限的[2, 40]。然而，GEMM可用于提供有用的能洞察肿瘤细胞起源和启动事件的研究。
使用血清培养细胞系建立的异种移植模型可追溯到20世纪60年代末。然而，研究表明，这种异种移植的肿瘤表现出在原发肿瘤组织中未发现的不同的形态学和分子特征[4, 6]。随后，通过开发PDX模型克服了这些问题。研究显示，从患者来源的胶质瘤细胞系或肿瘤移植物建立的原位异种移植模型具有更好的临床相关性[41-43]。这是由于存在正常脑实质提供的微环境，其可以更好的评估药物递送和清除动力学的测量。原位PDX模型作为高发病率肿瘤的研究是非常有用的，并且在临床前研究中能够产生大批量动物实验数据。一些研究者提供了PDX肿瘤模拟其原始肿瘤的病理生理学和分子特征的证据[6, 44]。重要的是，该模型允许使用精准医学的核心能力，即分层临床材料来评估治疗反应。之前我们与其他研究者使用这样的在体脑肿瘤资源来检测临床胶质瘤数据库中的实验结果[7, 10, 14-17]。结果显示经体外药物治疗或基因操作细胞衍生的转录组模式映射到病人临床数据库，并决定原发性肿瘤表型。
尽管在研究药物治疗反应中频繁使用PDX模型，但我们应该认识到，免疫原性和微环境因素可能不会在PDX模型中得到充分体现。此外，根据肿瘤的类型不同[45]，移植物的不成瘤率可高达90％。这些局限性提示，利用小鼠模型用于提供研究时应酌情考虑。
启用基于精准医学的研究：突出生物样本库的重要性
合并来自患者材料（细胞、异种移植物和原发性肿瘤）的多平台数据并寻求利用分子数据解决临床和表型成像的脑肿瘤生物样本库将会推进分层医学的研究。需要在实验模型中建立有代表性、可扩展的和可重复性的低通道细胞系来进行新型抗癌药物的研发和临床前验证。在缺乏综合人类脑生物样本库的情况下，来自神经系统疾病的体外和体内模型，在实际的疾病背景中往往不能得到功能验证。TCGA的研究表明，某些基因表达可驱动GBM疾病进展和生存结果[3, 46-48]。虽然胶质瘤进展的重要预后因素依赖于世界卫生组织（WHO）分级方案，但治疗反应和存活的广泛差异提示，胶质瘤的治疗不能仅由组织学决定。这些发现强调了仅依靠形态学标准诊断患者的局限性。未来的脑肿瘤分类必须包括分子信息，进而指导诊断和随后的治疗策略[49]。用于人类疾病研究的国际资源生物样本库的开发和维护为科学界提供了表征丰富的细胞和表型数据。利用回顾性临床信息评估相关模式和直接验证相关机制，能够促进建立小鼠相应疾病模型。
靶向治疗方法是一种具有吸引力的方法，可用来克服GBM的高度炎症反应和复发可能性。近来表观基因组、肿瘤组织的体细胞突变和转录组的表征提供了对基础疾病表型改变的更深入理解[2, 3, 50, 51]。使用无监督的计算方法来评估肿瘤细胞的潜在模式，以辨别它们的分子异质性。一个重要的评价是计算识别可用于小分子药物靶向调控的途径。这些预测在PDX模型中进行功能验证。针对高度可变的基因仔细检查异种移植物和原发性肿瘤的转录组信息，可以反映原发性肿瘤和GPC建立的异种移植物之间存在的偏差。这种共同的和系统的偏差可以通过诸如基于Anova的批量效应和基于主成分分析的统计计算方法来控制和消除[52, 53]。计算跨匹配的原发性和原位肿瘤的主成分散点图显示了匹配样品的接近，表明GPC可以在体内重建原始肿瘤分子谱（图4.1）。
来自生物样本库的患者肿瘤和GPC的匹配分子数据的计算评估需要使用生物信息学方法进行分子谱系统验证。需要计算流水线来整合由GPCs衍生的基因标签（转录组分类器）和来自患者分子数据的大量独立预测数据库集合[12, 54, 55]。GPC上的分子干扰实验已经提供了在预测数据库和体内实验中获得患者预后的有力证据[13, 15]。TCGA建立了最全面的胶质瘤患者数据库，其中临床表型和基因组信息的关键组成部分编目为33种不同肿瘤类型的多层组织结构[56]。每个层次都受限于基因组平台的数据结构，包括体细胞突变、拷贝数、甲基化、转录组和蛋白质组学技术。重要的是，我们已经通过调整统计框架来控制跨不同集合的系统批次效应，从而将我们的细胞和异种移植肿瘤分子模式与国际收集方式相融合[52, 53]。这种综合评价也证实了肿瘤细胞类型的一致性，并提供更大的统计学功效[57]。我们已经成功地应用了定性富集管道、连通性图（CMAP），以询问活性通路程序，用生物库细胞转录组信息来解码器基因特征[12, 13, 17]；然后通过存活状态、临床反应参数和来自CMAP管道的富集得分作图来回顾性地预测患者预后。因此，分子干扰实验可以借助生物学的有效工具——生物样本库，来验证了以患者为中心的计算预测。
结论
基于精确医学研究的核心能力是将生物样本库与深度分子表征相结合（图4.2）。在小鼠中重建脑肿瘤研究模型的能力可促进计算预测网络通路的生物学和功能验证，应作为靶向治疗的终极目标。
作者：Tan SY et al. 【National Neuroscience Institute, Singapore】
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