本文原载于《中华胃肠外科杂志》2016年第1期
精准治疗是基于基因差异而进行的个体化治疗。即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。自2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情咨文中提出精准医疗计划（precision medicine initiative），指出精准医疗可以'更接近治愈癌症、糖尿病等疾病，同时让我们自己以及家人能够获得更多保障我们健康的个性化信息'。从而将精准医疗推上了国际舆论的风口浪尖，其中肿瘤治疗成为精准医疗的短期目标。
结直肠癌是世界范围内的第三大癌症，2012年发病140万例，死亡694 000例。大部分患者确诊时即为Ⅰ～Ⅲ期，合并有肠道或区域淋巴结转移，其中大约1/3出现了远处转移。有相当一部分患者手术后复发或出现远处转移，这说明除了目前的TNM分期，还需要更多的评估来指导结直肠癌的诊治。
结直肠癌是一种遗传异质性的疾病，肿瘤临床病理特征相同的患者却对治疗有截然不同的反应和生存率[1]。近年来，随着奥沙利铂、伊立替康以及靶向药物的发展，转移性结直肠癌的生存期明显延长。随着新一代测序革命性地改变了人类基因组分析能力，全基因组测序、外显子测序、基因表达谱和表观基因组以及蛋白质组学研究，将重新刷新人类对结直肠癌分子水平的认识。因此，通过分子诊断技术对肿瘤分子生物学行为进行研究，可以帮助我们进一步理解结直肠癌。这些成果可以转化为指导临床靶向治疗和改变预后的技术基础，从而对结直肠癌进行个体化的精准治疗。本文旨在讨论这一领域的新发展和复杂性，及其在影响未来治疗策略方面的潜力。
1．MSI表型：
大约15％的结直肠癌存在染色体组不稳定，而染色体组不稳定，是由于不同程度的微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）造成的[2]。通过PCR和免疫组织化学染色（免疫组化）检测可以定量分析微卫星的稳定程度。存在2个以上标记位点不稳定的定义为高不稳定型（MSI-H）肿瘤，存在1个标记位点不稳定的称为低不稳定型（MSH-L）肿瘤，没有标记位点不稳定的称为稳定型（MSS）肿瘤。全基因组测序表明，微卫星不稳定可能影响大约300 000标记位点[3]。因此，需要更多的研究，将微卫星不稳定造成的影响和临床表现的多样化联系起来。
DNA错配修复系统（MMR）失效导致了MSI亚型的产生，大约1/3的MSI-H表型是由于MMR种系（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）突变引起的，这一类突变导致林奇综合征（Lynch syndrome），一般又称为遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC），一种常染色体显性遗传性结直肠癌[4]。患Lynch综合征的人一生中患结直肠癌的可能性最高可接近80%，而且其结直肠癌发病年龄提早，平均诊断年龄约45岁。Lynch综合征的女性患者子宫内膜癌的终身风险增加6~ 20倍。
更多的MSI-H亚型是散发的，由于表观遗传学和遗传学方面的改变引起的[5]。散发的MSI-H亚型中只有少部分发现MMR基因突变，其余的大部分是由于MLH1启动子的甲基化[6]。研究发现，MSI-H表型与某些临床特点相关，包括女性、老龄散发病例、肿瘤位于近端位置、低分化病理表现、分泌黏液和炎性反应以及丰富的BRAF基因突变[7]。这类MSI-H亚型患者，在诊断时肿瘤分期一般比较低，并且较少出现远处转移。在I、II、III期患者中，与MSS亚型肿瘤的患者相比，MSI-H肿瘤患者的预后较好。MSI-H结直肠癌病理组织学特征是肿瘤周围和瘤内淋巴细胞浸润，这类患者预后良好，在一定程度上归因于局部较强的抗肿瘤免疫反应[8]。微卫星不稳定和免疫炎性反应的关系促进了免疫相关的抗PD-1单克隆抗体的研究。临床试验表明，抗PD-1通路单克隆抗体在黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌和膀胱癌等治疗中具有显著疗效[9]。
除此之外，在Ⅱ期结直肠癌患者中，MSI-H表型代表预后较好，复发率较低。同时越来越多的数据表明，肿瘤存在错配修复基因缺陷（dMMR）或者MSI-H，提示单氟尿嘧啶类药物化疗反应不佳，甚至可能是有害的[10]。因此，对于Ⅱ期结肠癌辅助化疗在两可之间的患者，可以进行MSI检测。明确为MSI-H表型的患者，由于预后较好（90％的5年生存期），可能不需要接受化疗。实际应用中，最常见的错配修复蛋白的免疫组化，可以替代需要几周才能做完的MSI的PCR检测[11]。
2．高突变表型：
不同患者结直肠癌细胞中的突变频率可能非常不同。目前，将高突变亚型定义为每106碱基对的突变>12个，该亚型约占总体结直肠癌肿瘤的16%。它们可能是DNA错配修复基因或DNA修复基因（如POLE）的体细胞突变导致的[12]。另外，50％的高突变亚型会出现TGFBR2和BRAF突变，而在非高突变的肿瘤中，这两种基因的突变频率仅为5%。非高突变亚型的肿瘤与原位上皮内瘤变（CIN）密切相关。这一类型的肿瘤中，常见的突变包括APC、TP53、KRAS、PIK3CA、 FBXW7和NRAS。这说明高突变和非高突变的结直肠癌的肿瘤发生进程是不同的，而与之相关的临床表现和化疗反应还需要进一步的研究证实。
3．零星的突变：
在KRAS外显子4上氨基酸K117和A146的突变，预示着非常好的临床预后，患者即使是进行了转移癌的切除术，远期也无死亡[13]。如果这一发现在更大的临床研究中得到证实，那么外显子4的突变就可以定义为一种新的结直肠癌的亚型。这类患者将接受更积极的外科治疗，以达到肿瘤减灭以及转移癌切除的目的，从而获得更加良好的预后。
随着基因表达谱和二代测序的进展，专家更推荐通过肿瘤的生物学行为将结直肠癌进行分类，现在非常需要确证这些内在的分类，以发展出一个更具实际操作价值的结直肠癌分型系统。
1．表皮生长因子受体（EGFR）通路：
EGFR及其下游的信号通路和一些实体肿瘤的始动和保持有明确的关系[14]。以EGFR为药物靶点的药物研究是过去10年来的重点，目前有两类药物经核准可以应用于进展期结直肠癌，即抗EGDR单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂。但是，阻滞EGFR或TKIs信号通路的药物在进展期结直肠癌患者的应用并没有取得像其在乳腺癌和肺癌中那么明确的成功。免疫组化检测筛选出的EGFR表达的结直肠癌患者，使用抗EGFRmAb后，他们的获益和药物使用仅存弱相关性[15]。
一个里程碑式的发现是，结直肠癌患者携带原癌基因KRAS的突变，可以直接激活下游的MAPK信号通道，是引起抗EGDR单克隆抗体无效的原因[16,17]。甚至，对携带KRAS突变的患者使用抗EGFR单克隆抗体可能还是有害的。KRAS的突变检测可以预测患者对EGFR单克隆抗体的反应，但不是Ⅱ期或Ⅲ期直肠癌的预后影响因素[18]。
深入的突变分析和表达分析，使我们了解了结直肠癌对抗-EGFR治疗反应背后的机制。目前，非选择性应用抗-EGFR治疗的反应率为24%，KRAS/NRAS/BRAF/PI3KCA阴性肿瘤的反应率为40%[19]。但是，这还不能解释为什么50％以上患者对治疗无反应。种种综合分析表明，已知的生物标志物的突变尚不能解释为何导致EGFR持续激活。最有可能的原因是结直肠癌基因表达的复杂性和异质性。所以，需要更多更深入的研究，从表达组学的层面研究结直肠癌对抗EGFR治疗反应较低的原因，从而个体化地分析预测患者对药物的反应，以达到更好的临床效果和经济学效应。
2．RAF基因：
RAF是RAS的下游信号通路，它的点突变可以导致下游信号通路的持续激活，最常见的RAF基因突变在黑色素瘤中，结直肠癌中携带RAS突变的在其早期占10%～15％，晚期占8%[20]。其中BRAF突变和肿瘤距肛门的位置与微卫星稳定性相关。携带BRAF基因突变的患者如同时存在MSI高度不稳定即MSI-H，其5年生存率为73%，而如果为非MSI-H的BRAF突变，其5年生存率是46%。在晚期直肠癌患者中，BRAF提示较差的预后，总体生存率为9~ 14个月[21,22,23]。但是，高选BRAF(V600E）突变位点的小分子抑制剂的临床反应也较差，在转移的结直肠癌中只有5%[24]。原因可能是BRAF抑制后，EGFR通路被反馈性地激活，导致肿瘤持续增殖。所以，可能需要联合应用BRAF和EGFR抑制剂[25]。
3．PI3K/AKT信号通路：
PI3K/AKT信号通路可以通过介导EGFR，促进肿瘤的生长和生存。大约15％的结直肠癌出现外显子9和外显子20的突变，外显子20突变同时合并外显子9野生型的结直肠癌肿瘤与抗EGFR单克隆抗体耐药相关[26]。携带PIK3CA突变的结直肠癌患者，长期服用阿司匹林可以获得较长的生存期，而野生型的PIK3CA患者则无效。因为激活的PI3K促进了环氧化酶2 （COX2）的活性和前列腺素E2的合成，抑制了结直肠癌细胞的凋亡，而阿司匹林对此有拮抗作用[27]。
4．血管内皮生长因子（VEGF）：
目前针对VEGF通路的一线靶向治疗药物是贝伐单抗，其可抑制肿瘤血管形成。在转移性结直肠癌的治疗中，它与化疗药物合用，可以显著改善患者无进展生存（PFS）和总体生存期（OS）。但是其他看似前途光明、在肿瘤细胞株中反应良好的抑制血管生成的新药，却在Ⅲ期临床试验中折戟沉沙。目前，还没有一种有效的肿瘤标志物可以预测肿瘤对抗血管生成药物的反应。因此，还需要更多的研究，来深化对抗血管生成治疗的认识，以达到精准治疗的目的。
循环肿瘤DNA （ctDNA）是由肿瘤细胞通过凋亡和坏死过程，直接释放进入外周血的DNA，有取代活检诊断设置的潜力。由于ctDNA是整个肿瘤基因组的一个代表，它通常被称为'液体活检'[28]。检测少量样本中ctDNA的突变，可以帮助识别高危复发患者，这可能为个别患者监测化疗反应和制定治疗方案的指南[29]。然而，随着新技术的出现，不仅可以帮助监测ctDNA的已知突变，还可以通过动态观察治疗过程中的变化，帮助发现新的耐药机制[30]。另外，在治疗过程中使用全基因组测序，检测特定的基因拷贝数的变化，如KRAS、MET或ERBB2，可以判断治疗反应[31]。监测耐药基因的克隆在循环中的出现，可以比发现临床明显进展早数月[32]。因此，非侵入性监测肿瘤基因组的实时状态，可以帮助优化治疗。循环肿瘤DNA的分析是一种很有前途的工具，在一些前瞻性的临床试验应用，但是临床实践中的应用还是较少。
第一个被发现的结直肠癌分子亚型是MSI亚型。之后，随着高通量测序的研究，我们可以认识到肿瘤基因组中的体细胞突变和表观遗传学变化。对肿瘤分子生物学行为的了解使我们将之转化为靶向药物开发和肿瘤生物学标记物的发现。最好的例子就是通过检测RAS基因延伸变异的情况，筛选患者接受抗EGFR单克隆抗体治疗所取得的成就。然而，还有很多结直肠癌亚型相关的分子机制没有揭示，而靶向治疗反应方面最重要的绊脚石，就是不同结直肠癌患者之间显著的遗传异质性。所以，结直肠癌更需要分子诊断学的研究，进一步揭示结直肠癌分子层面的区别以及循环肿瘤DNA的检测，以达到精准治疗和个体化治疗，最终取得良好的疗效和经济学效应。
参考文献（略）
（收稿日期：2015-10-30）
（本文编辑：卜建红）
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