非小细胞肺癌免疫治疗的生物标志物检测

——声明：仅供医疗专业人士参考

编者按：《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南(2021版)》近期已在《中华病理学杂志》发表。本指南基于国内临床实践数据及结合中国国情，以国内上市靶向治疗药物及体外诊断检测试剂为导向制定，重在对分子病理检测临床实践的指导。为了更好地让读者理解指南，阿斯利康联合91360智慧病理网邀请国内临床及病理专家就本指南中的相关问题进行解读。本期91360智慧病理网邀请广东省肺癌研究所张绪超教授对免疫治疗的原理、NSCLC免疫治疗现状、NSCLC免疫治疗生物标志物及其相关检测以及存在的问题进行全面梳理。

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专家介绍

张绪超

博士，博士生导师。广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究中心主任、华南理工大学第一临床学院广东省肺癌研究所研究员、广东省肺癌转化医学重点实验室副主任。2018广东省杰出青年医学人才。兼任中国临床肿瘤学会（CSCO）理事会常务理事、CSCO肿瘤生物标志物专家委员会秘书、广东省转化医学会肿瘤学分会主任委员、广东省抗癌协会肺癌专业委员会常委、广东省抗癌协会靶向治疗专业委员会副主任委员、广东省抗癌协会分子诊断委员会候任主任委员、广东省药理学会肿瘤药理专业委员会副主任委员、美国临床肿瘤学会（ASCO）会员、美国癌症研究协会（AACR）会员、欧洲肿瘤内科学会（ESMO）会员、国际肺癌研究协会（IASLC）会员。

研究方向为肿瘤的分子标志物与转化应用研究，主要涉及癌症预测预后分子标志物、肿瘤的细胞与分子异质性、肿瘤免疫微环境、癌症转移机制、肿瘤遗传变异检测技术等。着重在肿瘤的临床分子靶点和相关信号通路分析及肿瘤进化和耐药机制方面开展研究。获得国家自然科学基金2项，省部级科研基金多项。参与“863”课题、卫计委行业专项及国家自然科学基金多项。

参与获得国家科技进步奖二等奖1项、中华医学会医学科技一等奖1项、广东省科技成果奖3项。在Science增刊发表综述，在Nature Communications、Journal of Clinical Oncology、Annual of Oncology、Clinical Cancer Research、Journal of Thoracic Oncology、Molecular Cancer等杂志以共同第一作者、第一作者或参与作者发表SCI文章五十余篇。作为主要完成人获得国家发明专利2项。主要参与制定CSCO 肺癌主要驱动基因EGFR、ALK、临床NGS技术应用等检测共识制定。研究论文获得“CSCO中国肺癌学术翘楚奖”、中华医学会呼吸病分会“高影响力呼吸学术论文奖”。

非小细胞肺癌免疫治疗的生物标志物检测

01

免疫治疗及其原理介绍

程序性死亡配体1(PD-L1)是程序性死亡1(PD-1)的主要配体，PD-1是一种共抑制受体，可在髓系、淋巴系、正常上皮细胞和肿瘤中组成性表达或诱导。在生理条件下，PD-1/PD-L1相互作用在免疫耐受的形成过程中起着至关重要的作用，防止过度的免疫细胞活动导致组织破坏和自身免疫。PD-L1的表达是多种恶性肿瘤利用的一种免疫逃避机制，通常与较差的预后有关。近些年来，抗PD-1/PD-L1药物作为一种新型的抗癌治疗药物，对非小细胞肺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的预后有了极大的改善。PD-1/PD-L1检查点在外周组织中起作用，作为T细胞的负调节因子，帮助控制局部炎症反应和维持自身耐受性。PD-1在活化的T细胞、自然杀伤细胞和B细胞上表达^[1]。它有两个已知配体—PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。PD-L1在部分巨噬细胞上表达，不同的组织和肿瘤在干扰素-γ和其他炎症介质的诱导下可迅速上调^[2-4]。PD-1在肿瘤浸润性淋巴细胞中的持续上调，肿瘤细胞利用PD-L1的表达来逃避免疫监视。PD-L1激活PD-1后通过丝裂原活化蛋白激酶/ERK通路上调Slug、Snail和Twist，提示肿瘤侵袭性和抗肿瘤免疫控制之间存在联系。

02

非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂（ICI）治疗现状

大约20%-30%的非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤细胞和浸润性免疫细胞中表达PD-L1（TPS>50%）。其中PD-L1阳性的NSCLC的特点是淋巴细胞浸润较少，无病生存时间较短^[5]。但近些年来，随着PD-L1抑制剂的有效应用，取得了可喜的临床效果。在用阿替唑珠单抗治疗184例非小细胞肺癌患者的研究中，临床反应与PD-L1阳性浸润性免疫细胞的表达量相关^[6]。在关于晚期非小细胞肺癌的pembrolizumab的主要研究Keynote-001、Keynote-010和Keynote-024中，较高的肿瘤PD-L1表达在治疗后曲线中预示着更好的疾病无进展、总生存率和临床应答率，在非鳞状NSCLC用Nivolumab单抗治疗时也观察到类似的结果^[7-8]。

03

免疫治疗生物标志物检测

3.1 PD-L1
    以组织病理为基础的PD-L1表达是预测免疫治疗的首要指标。肿瘤细胞上PD-L1的表达已被证明与PD-1/PD-L1抑制剂治疗NSCLC的疗效有关^[9-10]。然而， PD-L1的表达水平在免疫组织化学分析中是异质的和动态的，具有不同的检测抗体，以及不同的评分临界值，这使得对结果的解释变得复杂^[11-12]。因此，如何更加合理精准地判读PD-L1也是目前病理诊断关注的焦点，随着越来越多的PD-1或PD-L1抑制剂在NSCLC一线治疗中越来越多的获益，其他肿瘤的伴随诊断及临床治疗也会获得更多的成果。
3.1.1 PD-L1表达与非小细胞肺癌临床病理学特征之间的关系

在PD-L1高表达的晚期非小细胞肺癌患者(肿瘤细胞中≥的50%)，用于一线免疫检查点抑制剂单一疗法的pembrolizumab可提高无进展和总存活率^[13]。FDA批准将22C3 PD-L1 IHC法作为Pembrolizumab的伴随诊断中，34-66%的非小细胞肺癌患者PD-L1染色阳性(≥1%的肿瘤细胞)，11-30%的非小细胞肺癌PD-L1高表达(≥50%的肿瘤细胞)。多量研究已经表明，PD-L1在非小细胞肺癌中表达量越高，提示临床治疗效果越好。
3.1.2 PD-L1检测及其平台

由于PD-1和PD-L1抑制剂以PD-1/PD-L1为靶点，效应器T细胞和TC之间的相互作用从而释放免疫应答，通过IHC研究预测性的生物标志物PD-L1的表达是显而易见的。IHC作为一种可预测的生物标志物检测方法，具有广泛的应用性及成本效益、快速性和成熟性，例如用于检测致癌基因HER2、ALK或ROS的改变。PD-L1免疫组化检测试剂盒/抗体主要有五种：22C3、28-8、SP263和SP142，分别在两个免疫组化平台Dako和Ventana进行检测。PD-L1检测目前遵循一药一诊断原则，对于Nivolumab药物我们要进行Dako 平台的28-8抗体检测，Pembrolizumab药物也需要Dako 平台22C3抗体进行检测，Atezolizumab药物需要Ventana 的SP142抗体进行检测。目前在中国和美国都已经获批了非小细胞肺癌的多个适应症，对于不同的瘤种，判读标准有所差异，对于非小细胞肺癌我们采用28-8抗体及22C3抗体采用的是TPS的判读，SP142抗体在非小细胞肺癌中除了判读肿瘤细胞外还需判读免疫细胞。
3.1.3  临床PD-L1检测中的常见问题及解决策略
3.1.3.1 不同抗体要求使用不同的检测平台。主流检测平台为两家公司的4种抗体检测平台，分别为DAKO 22C3和28-8检测的AutoStainer Link 48平台和Ventana SP142和SP263检测的Ventana Benchmark Ultra平台。使用专有抗体进行共同开发的不同 PD-L1 IHC诊断将会对其作出标准化的评估。
3.1.3.2  不同的抗体检测结果判读标准不同。目前主要PD-L1检测抗体使用的判读方法有TPS、CPS以及分别计算TC和IC的判读方法，不同判读方法的主要差异在与是否计算肿瘤区域阳性表达的免疫细胞数量。以相对统一的检测模式或辅以人工智能计算评估等目前都在深入研究中，希望这些策略为这类问题提供解决方案。
3.1.3.3 同一抗体在不同的肿瘤中判读方法不同。FDA批准22C3抗体的说明书中指出针对非小细胞肺癌使用TPS的判读方法，但针对其他部位的肿瘤，则建议使用CPS的判读方法。因此PD-L1的判读需要专业的病理医生经过大量的训练才能保证判读的准确性。而对病理医生专业地、反复地、规范化地训练将使其在未来PD-L1的判读上更加统一。
3.2  肿瘤突变负荷
3.2.1 肿瘤突变负荷定义

肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)定义为一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。

一般来说，癌症基因组内的体细胞突变是一个多因素过程，这些因素可能为内源性和外源性，前者包括DNA修复基因或参与DNA复制基因的缺陷或改变如聚合酶ε(POLE)，后者如吸烟或紫外线暴露。体细胞高度突变可能导致突变基因编码的蛋白修饰，这种修饰的蛋白被免疫系统识别为“非自我”，随后作为肿瘤特异性新抗原激活特异性抗肿瘤免疫反应。

新抗原的产生不一定与更高比例的体细胞突变有关，但后者可能增加产生新抗原的可能性。因此，具有高度非同义TMB的肿瘤表达大量异常蛋白，这些异常蛋白被免疫系统识别为新抗原。因而，TMB高提示产生的新抗原多，应用免疫检查点抑制剂释放的T细胞更有可能识别新抗原，从而达到攻击和杀死肿瘤的作用，因此肿瘤组织中TMB检测可能有助于预测免疫检查点抑制剂的疗效。
3.2.2 肿瘤突变负荷的检测

目前检测TMB的方法主要为基于二代测序技术(NGS)的全外显子测序(WES)和大panel测序。

由于癌症进展过程中可能累积的大量变异，这些突变可能导致新抗原产生，而WES检测存在于整个外显子中的体细胞突变，可以提供肿瘤进展中起作用突变基因的全貌，因此TMB理论上最好由WES检测。然而，由于WES成本高以及操作繁琐，如果活检组织太小或没有足够的肿瘤细胞就难以得出准确的结果，另外还需要配对的正常DNA，因此由该技术检测的TMB很难作为预测肿瘤免疫治疗疗效的一种常规临床方法.

基于NGS的靶向基因套餐（panel）被设计用于TMB检测，目前主要有FoundationOne CDx NGS和MSK-IMPACT NGS平台。FoundationOne CDx NGS平台将TMB定义为在靶向基因的编码区内碱基替换(包括同义突变)的数量，基因组DNA不需要测序，但需要使用公共和私人变异数据库进行致癌驱动事件和胚系状态的过滤。总突变/兆碱基(mut/Mb)的计算包括同义突变和非同义突变，这两种突变都需要一个转换公式才能转换为WES确定的错义突变数量。MSK-IMPACT NGS平台使用来自肿瘤和胚系DNA的测序数据对非同义突变进行比较。该平台的最新测序panel可以测序468个基因，覆盖1.22Mb。一些研究显示TMB的Panel检测与WES检测具有很好的一致性，可以有效地预测对免疫检查点抑制剂治疗的反应。
3.3  微卫星不稳定

微卫星不稳定性(MSI)和错配修复缺陷(dMMR)都代表是一种免疫缺陷的表型。MSI和dMMR肿瘤具有高度的免疫原性，它们已被用作评估免疫治疗疗效的生物标志物，并已在抗PD-1的临床试验中得到证实。已经证实了在不同MSI-High/dMMR肿瘤中免疫治疗有较高的总应答率(ORR)，美国FDA首次批准对MSI-High或dMMR的不能切除或转移的实体肿瘤患者进行治疗，而这一评估体系与肿瘤组织学无关

04

小结

通过免疫组化检测PD-L1表达水平已成为晚期NSCLC免疫治疗疗效预测标志物分析的标准方法，也可用于指导其他类型肿瘤ICI的治疗方案。PD-L1评分算法以及不同的平台检测对于药物和肿瘤类型之间可能存在显着差异。因此，各平台方法之间的一致化评价、培训和持续教育对于准确解读PD-L1至关重要。科学界也正在努力寻找的其他类别的ICI相关预测标志物，随着很多新的研究结果出现，组合生物标志物可能可以更好地捕捉复杂的生物学背景，从而进一步识别最有可能受益于PD-1/PD-L1靶向免疫治疗的患者。
 
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