今天要给大家拆解的文献是今年5月刚刚发表在Aging上的文章，影响因子5.515。文章题目是Identification and validation of hub microRNAs dysregulated in esophageal squamous cellcarcinoma。从标题很容易看出本研究是常规的hub基因研究，但本研究之所以能发表在5分+上，我觉得一是文章研究的是microRNAs，有所新意；二是文章还做了点简单的实验对筛选出的两条microRNA进行了表型验证。
数据解构
挑——差异表达miRNA筛选
本文首先通过GEO数据库筛选食管癌差异表达microRNAs（miRNAs）。作者选用了GSE114110和GSE43732两个数据集进行分析。值得一提的是，作者还利用R语言的limma包对数据集进行了标准化处理。作者设定的阈值为|log2FC|≥ 1和P < 0.05，由图E和F的火山图可以看出筛选出的差异表达miRNAs相比于平时我们筛选mRNA时是要相对少一些的。作者使用的是limma包进行的差异表达分析，使用GEO数据库的在线工具GEO2R也能达到同样的目的。筛选到差异基因后，作者使用R语言VennDiagram包制作韦恩图，使用网站Draw Venn Diagrams （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）也可做出类似的图。最终筛选得到3个上调的和5个下调的miRNAs。
此外再提一句，在分析多个数据集时，可以将多个数据集的数据合并分析，但是必须得先去掉批次效应。如果不想去进行去批次的操作，可以像这篇文章这样采用取交集的方式，这样也算是有一定道理的。
联——miRNA靶基因预测
miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）是一个经过实验验证的miRNA-靶基因相互作用数据库，作者利用这个数据库对8个差异表达的miRNA的靶基因进行了预测。3个上调的和5个下调的hub miRNAs总共分别预测出468和753个可能的靶基因。
除了miRTarBase网站外，常用的miRNA靶基因预测网站还有Targetscan、ENCORI、miRDB、miRWalk等。
圈——miRNA靶基因GO和KEGG富集分析
联——PPI网络分析得到hub基因，miRNA-hub基因互作网络构建
作者又使用STRING数据库对预测出468和753个可能的靶基因分别作了蛋白蛋白互作（PPI）分析，并进一步地利用Cytoscape软件筛选得到hub基因各10个。然后对这20个基因做了GO和KEGG富集分析。本文作者将GO分析的三大类：生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）分开展示，并对靶基因、hub基因分别做富集分析，因此得到的图比较多。
随后，作者利用Cytoscape软件构建miRNA-hub基因网络。由于miR-196a-5p和miR-1-3p所关联的hub基因最多，作者进一步地利用miRNACancerMAP数据库分析了miR-196a-5p和miR-1-3p所涉及的信号通路。
miRNACancerMAP（http://cis.hku.hk/miRNACancerMAP/）是一个可以预测、构建癌症miRNA调节网络的在线工具，只需点击网站上方的Quick Search，输入想要研究的miRNA，即可得到分析结果。
靠——miRNAs预后价值分析
随后，作者利用利用TCGA数据库、细胞系以及临床样本验证了miR-196a-5p和 miR-1-3p的表达情况。并利用基于TCGA数据的starBase数据库对miR-196a-5p和miR-1-3p进行Kaplan-Meier生存分析，以评估其预后价值。
干湿结合
到这里其实这篇文章已经可以发表了，但最新的Aging已经不收纯生信文章了，要发5分必须补湿实验。
干湿结合的参考组合有：
1、生信+临床标本验证
2、生信+功能表型验证（细胞或者细胞+动物均可）
3、生信+临床+功能表型验证
4、生信+临床+功能+机制研究
这篇文章运用的是“生信+临床+功能表型验证”组合，作者做了一点实验来验证miR-196a-5p和miR-1-3p对食管癌细胞增殖和迁移的影响。所用实验为CCK-8、EdU和Transwell等常规实验技术，比较简单。这里作者只是用了miRNAmimics做实验，其实还可增加使用miRNA inhibitors的实验。
总结
到此全文就结束了，总结一下，作者先用GEO数据库筛选得到食管癌差异表达miRNAs（挑），然后利用筛选得到的8条miRNAs预测靶基因（联），并对靶基因进行富集分析（圈）；进一步地在靶基因中筛选得到hub基因（联），并筛出两条与hub基因联系最多的miRNAs（联）；最后对这两条miRNAs进行生存分析，来说明临床意义（靠），其实本文还可增加临床相关性分析，ROC曲线等分析进一步丰富内容。此外，这篇文章还增加了一点湿实验的内容：利用细胞系和临床样本验证两条miRNA的表达情况（临床标本验证），并利用细胞实验验证其对食管癌细胞增殖迁移能力的影响（功能表型验证）。
整体来说，全文基本全部按照“挑、圈、联、靠”的生信套路来进行，所用技术以在线工具为主，适合初学者模仿。
最后再给大家归纳一下干湿结合研究套路模板（加粗的是本文所用的方法）：
干：
挑：差异表达分析筛选目的基因
圈：GO/KEGG富集分析、GSEA富集分析、WGCNA网络分析、其他特殊分析（miRNA相关通路预测、免疫浸润等等）
联：蛋白蛋白互作（PPI）分析、miRNA交互作用、分子网络构建
靠：生存分析、临床相关系分析、单因素/多因素分析、差异表达预后分析、ROC曲线
湿：
1、临床标本验证（包括细胞系和临床样本）
2、功能表型验证（细胞或者细胞+动物均可）
3、临床+功能表型验证
4、临床+功能+机制研究
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