特别推荐Cell Stem Cell丨独当一面？类器官真的准备好了吗？

Live mouse gut organoid.图片来源：https://www.nikonsmallworld.com/galleries/2012-photomicrography-competition/live-mouse-gut-organoid

3D培养技术的最新发展使胚胎干细胞或诱导多能干细胞和成年哺乳动物干细胞表现出显著的自我组织特性，而由此产生的类器官可以反映不同器官如肾、肺、肠、脑和视网膜等的关键结构和功能特性。来源于多能干细胞（PSC）的类器官对于了解不含干细胞的组织（如大脑）的发育和疾病过程的机制具有重要的潜在作用。PSC能够同时分化成多个谱系，可以很容易地在实验室之间共享以对生物学的见解进行交叉验证，并且它可以从不同的遗传背景中获得，为研究基因变异对细胞类型、器官发育和功能的影响（包括与人类疾病生物学有关的基因变异）提供了前所未有的机会。同时，类器官技术避免了传统的2D细胞系培养的诸多缺陷，如细胞来源的限制、低保真度和低分化能力等，其应用不仅可以实现在培养皿中模拟人体器官发育和各种疾病病理复杂情况，患者来源的类器官还有望实现对药物反应的个性化预测等精准治疗【1,2】。人体组织类器官模型的创新无疑是研究发育和疾病的具有巨大潜力的实验平台。如今，很多研究人员开始以牺牲传统实验模型如原位组织或动物模型为代价来促进以类器官为基础的实验，但是，今天的类器官真的足够成熟，可以独当一面了吗？

近日，来自美国加州大学的Tomasz J. Nowakowski团队在Cell Stem Cell上发表文章“Are Organoids Ready for Prime Time?”，以大脑类器官为例，探讨了影响类器官模型效用的关键因素，提出目前类器官应用仍存在着缺陷和不足，甚至可能产生误导性结果，指出对原位组织进行系统的基准测试以确定相应类器官价值的重要性。

哺乳动物大脑的发育很大程度上发生在产前阶段，而且在不同物种之间存在很大差异。尽管动物模型的应用已经为理解大脑发育的基本机制提供了重要的帮助，但它们还不能复制人类特有的生物学特点。大脑类器官无疑为大脑早期发育研究打开了一扇窗。但是，大脑类器官的应用，要求我们不仅需要了解并严谨地评估它们的优点，而且要评估它们潜在的缺点。任何实验模型的实用性都取决于细胞命运决定的保真度和稳健性、高阶组织自组装的精度、以及体外和体内功能过程的准确性和动态。本文的作者从以下四个方面全面讨论了目前类器官技术的发展程度、存在的问题及可能的解决方法。

01

对类器官细胞类型的理解需加深

大多数神经系统疾病都具有细胞类型特异性，这就需要在大脑类器官模型中重现精确的细胞类型，以获得对神经和神经精神疾病的理解。目前，通过一些已知的标记基因，已经验证了类器官模型中的一些细胞类型，证实在体外分化过程中确实可以产生不同的细胞类型。但是，更广泛的细胞种类，如放射状胶质细胞、中间祖细胞、皮层上层和深层兴奋性神经元等，都需要更广泛的特征标记，以确定它们是否真实反映了人类复杂的大脑皮层中发现的丰富多样的细胞类型。而就目前的研究来说，我们对细胞类型的识别还是非常有限的。虽然传统的分析方法能够很好地揭示广泛的细胞类型之间的粗略关系，但是随着细胞分辨率转录组学和表观基因组学的出现，人们发现传统定义的细胞类别中存在着大量异质性，这就强调了对人类特定细胞类型和特征的更细致的理解的必要性。因此，除了利用已有的基因表达比较策略外，更全面地利用基因网络分析（如加权基因共表达网络分析）或单细胞轨迹分析（如RNA速率、scVelo和Monocle）以突出原位组织和体外模型之间的细微差别、并发现可以用于改善类器官体系的生物学过程将是非常有用的。当然，关注不同分析方法之间的数据差异将是非常重要的。

此外，除了细胞亚型特异性的缺失，神经类器官也常常出现不在特定解剖区域内或非神经谱系的非目标群体，如在皮质类器官的单细胞测序分析结果中可以观察到小胶质细胞和血管细胞。

由此提示我们，目前类器官体系存在的可重复性问题、不完善的细胞类型以及普遍缺乏成熟度的问题，都会限制其在研究细胞类型特异性相关的正常或疾病过程中的总体效应。

02

类器官的组织结构和功能有待提高

基于对广泛细胞类型可再生性的方案的改进，类器官研究面临的另一个挑战是如何使细胞组织成足以支持各细胞类型之间功能相互作用的空间型态。类器官的生长能力有限，当其超过一定大小时，很多细胞组织仍然是不成熟的。对大脑类器官来说，祖细胞区域的初步组织是共同特征，但有丝分裂后神经元外套膜的形成更具变数，主要神经元层的组织也并没有精确地再现，此外，目前皮质折叠（人类大脑皮层的一个显著特征）也难以完成。

类器官细胞的起始来源或许是这些问题存在的一个重要原因。当然，培养技术的革新，如旋转生物反应器和轨道振荡器，改善了类器官中心的氧化和营养供给，从而支持了整体组织的健康。此外，类器官切片培养有助于保存在培养过程中可能丢失的细胞结构组织。所有这些创新的生物工程方法都已经开始解决目前类器官存在的问题，以促进更大更成熟的类器官的生长，但是就目前而言，类器官仍然存在细胞结构组织的变异性和多能细胞系之间的大小差异。我们期待更多令人兴奋的生物工程技术的发展，但是这些都应该以原位人类皮质发育的细胞结构特征为基准。

03

类器官的保真性有待改善

诚如上文所述，尽管基因表达研究在解决细胞类型和状态方面有着前所未有的能力，并有助于改善体外方法，但它们在捕获细胞特性的特征方面仍然存在局限性。细胞的特性的完善是由形态学、表观遗传状态、蛋白质和小RNA丰度、连接性、细胞器组成和分布以及功能参数等特征共同完成的，而不仅仅是转录组学所反映的。而目前对类器官的代谢和生理机能保真度的评估仍是困难重重。而多模式比较，包括蛋白质组学、表观遗传分析、代谢组学和原位组织中细胞类型的电生理特性与类器官模型的结合，将更有效地确定细胞组成和代谢驱动的类器官方案的优化。此外，更好地认识类器官与体内组织之间的差异，也将促进新方法的发展，以提高类器官模型的保真度。

04

类器官不是唯一，多模型的整合才是王道

类器官培养被认为是进行人体组织实验研究的首选模型，但是不得不引起重视的是，类器官和原位组织之间的功能差异可能对理解真实疾病机制的生理过程有着重要的影响，而这些潜在的重要差异往往是最容易被忽视的。如果由此研究出来的候选途径或机制在开发新的疗法之前没有得到验证，那么这些差异可能会付出以病人的健康和安全为前提的巨大代价。

因此，类器官模型不能成为唯一，作为对其的制衡，基于原位组织和动物模型的研究仍将是生物医学研究的金标准（图1）。这些实验模型能够研究目前类器官无法触及的高阶特征，如复杂的脑回路、动物行为和生理等。当然，新技术的发展、生物工程的创新和培养技术的改进可以使人类组织的长期培养成为可能，从而使功能性基因实验成为可能。但是，利用基因编辑的创新、细胞型特定病毒和其他可用于研究特定基因的分子工具，经典的动物模型、非模型生物和体外培养等方法仍可以很好的用于功能实验的研究，它们不应该被类器官模型所取代。

图1 多模型的整合

综上所述，类器官已经成为一种吸引人、易于从多能干细胞系复制的人体外组织模型，但是，以大脑类器官为例，其与原位细胞类型之间仍存在着很多差异，从而可能会混淆人们对内源性脑功能的认识，并可能提出关于神经病理学的误导性假设，最终可能误导治疗方法。这就需要对原位组织中的每一种细胞特性进行深入的了解和表征（图2），包括通过结合转录组、表观基因组和蛋白质丰度等方法来表征的细胞类型；包括空间组织、形态和物理连接性参数的细胞结构组织；以及包括代谢状态和电生理在内的细胞和组织功能指标。毫无疑问，今天的类器官还无法独当一面，而未来，它也不需要独当一面，多模型的整合才是研究的最佳方案。

图2 表征原位组织的细胞特性以改良类器官模型

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.08.013

制版人：琪酱

参考文献

1. HansClevers. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016,16;165(7):1586-1597.

2. FransSchutgens, Hans Clevers. Human Organoids: Tools for Understanding Biology andTreating Diseases. Annu Rev Pathol. 2020, 24;15:211-234.