撰文：huacishu
IF=38.332
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亮点：
1、该研究阐释了肿瘤核型的改变率和多样化模式，这为理解非整倍体基因组进化的历史轨迹和时间动态提供了有价值的参数。
2、研究表明非整倍体肿瘤核型原则上可以在一个错误的细胞分裂中产生，为癌症发生的早期阶段恶性核型的间断进化提供支持。
荷兰乌得勒支大学Hugo Snippert教授团队在国际知名期刊Nat Genet在线发表题为“Reconstructing single-cell karyotype alterations in colorectal cancer identifies punctuated and gradual diversification patterns”的研究论文。肿瘤进化的核心是遗传多样性的产生。然而，核型改变在人类肿瘤中出现和传播的程度和模式尚不清楚，特别是在单细胞分辨率上。本文中作者提出了3D-实时序列方案，该方案整合了肿瘤类器官生长的活细胞成像和每个成像细胞的全基因组测序，用以重建连续细胞世代中进化的肿瘤细胞核型。利用患者来源的结直肠癌类器官和新鲜的肿瘤活检，作者证明了不同复杂性的核型改变是普遍存在的，并且可以在几个细胞世代内出现。相反，在一次错误的细胞分裂中产生了全基因组的核型改变，为非整倍体肿瘤基因组可以通过间断进化提供了支持。绘制癌症核型多样性的时间动态和模式具有重要意义。
为了研究在单个肿瘤细胞克隆生长过程中从头染色体拷贝数变异（CNA）出现和繁殖的程度，作者开发了一种方案，允许对来自单个类器官的整个细胞群体进行单细胞全基因组测序（图1a）。利用这个方案，对两名结直肠癌（CRC）患者的克隆性肿瘤类器官中的高比例（约90%）细胞进行了重复测序：PDTO-9（微卫星稳定）和PDTO-19b（微卫星不稳定）。来自两个PDTO的测序数据显示细胞间从头开始的全染色体以及亚染色体拷贝数变异（图1b，c）。从单个克隆PDTO中捕获整个细胞群具有检测细胞间相互拷贝数增益和丢失的关键优势细胞，指示这两个谱系是同一祖先拷贝数变异事件的后代（图1b，c）。在整个数据集中，PDTO-9和PDTO-19b的拷贝数变异事件发生率约为十分之一（图1d）。值得注意的是，作者确定了相同的拷贝数变异从单个PDTO-9类器官内的独立事件中出现的实例，这些实例通过同时出现额外的拷贝数变异来区分，这些拷贝数变异禁止组装一致的单一系统发育（图1b）。事实上，作者经常检测到多个拷贝数变异同时出现的细胞分裂。极端的病例表现为具有高度异常核型的PDTO-19b细胞亚群，被定义为可能显著改变适应性的全基因组倍性变化。其中两个细胞在其基因组中显示出广泛的相互拷贝数变异（图1c），表明它们是单个细胞分裂的后代。这两种核型的总和都指向一个基因组重复的祖先，这与极端非整倍体状态通常由不稳定的四倍体中间体进化而来的模型一致。总的来说，这些数据表明新生拷贝数变异在PDTO生长期间很容易出现和传播。
作者首先实现了3D实时序列，以研究新拷贝数变异是否与有丝分裂期间特定染色质错误相关。总之，作者生成了64个细胞分裂的高分辨率成像数据，每个细胞分裂来自单个肿瘤类器官（PDTO-9），以评估它们的染色质表型。然后对两个子细胞以及由解离的PDTO结构的剩余细胞组成的大样本进行测序（图2a）。正如所料，拷贝数变异几乎只在涉及染色质桥或滞后染色质的细胞分裂的子细胞中产生（图2b）。为了展示方案的可行性，记录了单个PDTO-9类器官在三代细胞中未受干扰的生长，并重建了真实的有丝分裂，详细描述了每个细胞分裂的有丝分裂保真度（图2c）。在单细胞分离之前，作者选择了一个感兴趣的细胞进行光转化，这是基于其之前细胞分裂过程中染色质表型的滞后（图2c）。来自13个细胞中12个细胞的单细胞测序数据显示了跨越三个谱系的几个拷贝数变异（图2c）。利用光转化细胞的测序结果作为标志，将7号染色体连续映射到有丝分裂树内突出显示的分支（图2c）。与之前的数据一致的是，7号染色体错聚的分裂显示了滞后的染色质表型向获得7号染色体拷贝的子细胞迁移（图2c）。由于其潜在的系统发育解决方案与有丝分裂的多个分支匹配（图2c），其余的拷贝数变异不能以高精度绘制。
在另一个PDTO-9 3D 实时序列数据集的光转换谱系中遇到了染色体9q的类似扩增，这使得在四个细胞世代中可以准确地定位其系统发育起源（图3a）。其中一个光转化细胞中9q染色体的扩增和谱系内所有其他细胞的相互丢失只能通过两个复制周期和无着丝粒9q染色体片段的集体错聚来协调。接下来，对细胞1（5个拷贝）、细胞2和3（1个拷贝）以及核型细胞（二倍体）进行了额外的深度测序，以提取每个染色体9q21.33端区域特有的单核苷酸变体（SNV）。正如预期的那样，含有染色体9q扩增的细胞显示SNV的有偏变异等位基因频率，有利于一个亲本等位基因，并且在一定程度上与两轮复制一致（图3b）。值得注意的是，在扩增的9q染色体片段中没有发现显色三倍体的迹象，这表明微核包膜保持完整。在每一个病例中，扩增的亚染色体片段都是无着丝粒的，这表明缺乏纺锤体微管连接导致复制的无着丝粒片段不分离。在后期，未连接的复制片段集体转移到一个子细胞，可能导致随机核或微核被遏制。
由于中心体扩增常常与全基因组加倍有关，假设由有丝分裂进入和退出缺陷引起的基因组复制细胞可以通过频繁激发多极纺锤体缺陷作为产生有核型的有效底物。事实上，在一次再复制事件后捕捉到了一个三极分裂，它产生了三个核型相反的子细胞（图4a）。为了证实上游有丝分裂滑脱引起的多极纺锤体缺陷能产生具有核型的子代，在有丝分裂滑脱后对细胞进行光转换，并在下一次细胞分裂后分离出子代。正如预期的那样，当两个子细胞产生的染色质质量相等时，作者检测到多倍体，但没有全基因组的错配染色体（图4b）。相反，当下游分裂产生三个子细胞时，表明多极纺锤体缺陷，分离的细胞显示出巨大的核型（图4b）。
为了更详细地研究细胞对核型的内在选择压力，在生长早期和成熟阶段捕获了大量PDTOs中的单个细胞谱系。总的来说，从年轻到成熟的类器官，染色体不稳定性的水平保持不变（图5a）。在生长的两个阶段都很容易检测到细胞凋亡，与以前的报道一致，在错误细胞分裂的后代中检测到细胞凋亡水平升高，特别是在多极纺锤体缺陷后（图5b，c）。对于仍处于增殖状态的细胞，在出现错误后立即向较长细胞周期转变并不显著（图5d）。然而，利用推导的似然比检验对有丝分裂树结构进行综合分析，再次表明有丝分裂错误后出生率下降的证据。为了从功能上探讨新核型的适合性，作者评估了来源于一个亲本克隆PDTO的单个肿瘤细胞的类器官形成能力。随后对新形成的单个类器官（体细胞）进行核型分析，可以作为种子单个细胞核型的替代物，并可以确认拷贝数变异的持续适合性。事实上，具有（亚）染色体核型改变甚至全基因组复制的细胞能够发展成新的PDTOs（图5e），这与作者的观察一致，表明从细胞内在和短期的角度来看，一些具有新核型的细胞保持高水平的适合性。
为了研究在由于选择而重塑核型格局之前，晚期CRC是否在体内产生相似程度的核型多样性，作者采用测序方法来测量新鲜冷冻人类CRC样本克隆谱系内的核型多样性。随后的单细胞分离和前瞻性基因组分析显示，细胞间的核型差异很大，近30%的细胞携带偏离核心腺体核型的拷贝数变异，这一数字与作者的PDTO数据一致（图6a）。相反，只有来自野生型的少数单个细胞显示出新发拷贝数变异，这与先前关于健康结肠组织中基础染色体不稳定性水平的报告一致（图6b）。值得注意的是，通过捕获大量克隆性肿瘤细胞（44%），检测到体内新生拷贝数变异的出现和繁殖（图6a）。此外，很容易识别出具有巨大核型的细胞（图6a），进一步证明在晚期癌症阶段正在产生具有全基因组核型改变的细胞。
该研究揭示了染色体不稳定性在连续细胞世代中的基因组结果。通过重建中间基因组状态，证明了全基因组和局部核型改变在晚期大肠癌中都是持续和普遍的。尽管如此，考虑到肿瘤可能由数千亿个细胞组成，适应性增强的低概率仍然具有潜在的影响。晚期癌症核型多样性的不断产生与最近对患者队列肿瘤基因组的分析是一致的。然而，由于这些研究大多衡量进化的净结果，因此很难理清核型多样性产生的速度以及影响它们形成非整倍体的选择压力。因此，对肿瘤核型的改变率和多样化模式的洞察为理解非整倍体基因组进化的历史轨迹和时间动态提供了有价值的参数。此外，作者的工作表明，非整倍体肿瘤核型原则上可以在一个错误的细胞分裂中产生，为癌症发生的早期阶段恶性核型的间断进化提供支持。
教授介绍
Hugo Snippert博士是乌得勒支大学医学中心分子医学中心分子癌症研究系的组长。2017年，他成为了一名肿瘤调查员。Hugo博士在汉斯·克利夫斯（Hubrecht研究所）的实验室以优等成绩获得博士学位，在那里，他利用先进的小鼠遗传学和显微镜来描述小鼠肠癌、皮肤癌和肠癌中的干细胞群。他的主要研究领域涉及细胞死亡，以及多个单独的细胞如何协同行动，以确保组织功能。Hugo教授还在国际权威期刊Cell、Nature Genetics、Nature Medicine上发表了多篇文章，主持撰写了多部相关专业著作。。
参考文献
Bollen Y, Stelloo E, van Leenen P, et al. Reconstructing single-cellkaryotype alterations in colorectal cancer identifies punctuated and gradualdiversification patterns [published online ahead of print, 2021 Jul 1]. NatGenet. 2021;10.1038/s41588-021-00891-2. doi:10.1038/s41588-021-00891-2
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