推荐一种快速设计qRT-PCR引物的方法

前几天看到生信交流群（群号：659344871）有童鞋问qPCR引物设计的问题，今天就给大家推荐一款在线引物设计神器：Primer-BLAST。它是NCBI的一个在线工具，网址是：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

 

下面就以比较著名的“SWEET”基因为例，看下如何设计qPCR的引物吧。

 

 cDNA序列的获取 

打开NCBI的首页，数据库选择gene，输入基因的名称（Gene symbol）SWEET1，如下图，然后点击Search 按钮。

 

在搜到的结果中，选择拟南芥的sweet1基因，单击基因名称，进入该基因的页面。

找到该基因的对应的转录本的ID，比如，NM_101997.3（以NM开头），单击进入详情页面。有了转录本的就可以进行引物设计啦，你也可以把相应的cDNA序列下载下来，方法如下图。

 

引物的设计

在Analyse this sequence 列表中找到Pick Primers单击，方法如下，进入引物设计页面。当然也可在NCBI首页的下部找到Primer-BLAST，单击进入相同的页面。

 

然后将PCR product size 设置为100~200bp，返回的引物数这里保持默认的10对，退火温度保持默认。

关于引物的跨内含子设计主要是为了避免cDNA的PCR过程受到基因组DNA的影响，引物是否跨内含子设计以及引物的特异性检测，这里保持默认设置即可，点击Get Primers 提交任务 。

一般等数十秒后，就会给出结果页面，它比OmicShare用的时间要久得多，需耐心一点。引物的图形展示页面如下，形象的展示了扩增片段的位置和大小。

 

滚动页面，就可看到引物的详细列表信息，如下图。嗯，接下来就可以进行后续的引物合成、筛选、PCR反应条件的优化等等。当然，Primer-BLAST也可以用来设计常规PCR的引物！

 

今天的内容就到这里啦~

 

参考文献

Chen LQ, et al. Nature, 2010Nov 25. PMID 21107422

Xuan YH, et al. Proc Natl Acad Sci U S A,2013 Sep 24. PMID 24027245