现代中西医结合杂志
ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2007Jul,16(19)
新一代溶栓药物纳豆激酶
邓立新
(海南省人民医院,海南海口570102)
[关键词]纳豆激酶;溶栓药物;血管栓塞
[中图分类号]R973[文献标识码]A[文章编号]1008—8849{2007}19—2775—02
血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一,是现今仅 次于癌症的第二大病症.目前,溶解血栓是治疗这一类疾病 的重要手段,当今用于临床治疗的药物包括链激酶(streptki— nase,SK),尿激酶(Umkinase,UK),组织型纤溶酶原激活剂(t— PA),单链尿激酶型血纤溶酶原活剂(ScUPA),化学修饰的血 纤溶酶一链激酶激活剂复合物(APSAC)等.这些药物均为 激活血液中的血纤溶酶原,从而降解纤维蛋白而间接地起作 用.临床应用方法是注射或滴注,有可能引起患者全身性内 出血,而且在血液中的半衰期很短(3,20min),因此在使用 这些药物时必须长时间的滴注用药,很不方便,且来源紧缺, 造价高.因此,开发新型溶血栓药物成为当前重要研究课题 之一.纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种能达到'经IEI纤溶 疗法'目的的,从世界数百种食物中筛选出来,安全性最高的 高效血栓溶解酶,有很强的溶血栓能力,跟传统的一些溶栓剂 相比,具有安全性好,成本低,口服有效等优点,极有可能开发 为新一代的溶栓剂.现将纳豆激酶的来源,理化性质,药理作 用,生产,与其他枯草杆菌蛋白酶的同源性比较,开发应用现 状综述如下.
1来源
纳豆激酶是由日本学者SumilJ于1987年首次发现的, 它是纳豆发酵而产生的一种具有强烈纤溶作用的酶,该酶能 明显缩短优球蛋白的溶解时间.他们在研究纳豆芽孢杆菌的 生理生化特征后,认为其分类地位应归在枯草杆菌中.须见 洋行于1987年对纳豆及其提取物首次作了系统研究,最初将 酶的提取物添加到纤维蛋白平板上,发现有明显的溶栓作用, 并确定是一种具有纤溶活性的激酶…,从而使其成为一种很 有潜力的新型溶栓药物.纳豆激酶在日本已得到广泛深入的 研究,在我国还刚剐起步.
2理化性质
2.1分子量,分子结构纳豆激酶是一条由275个氨基酸残 基组成的单链多肽,分子量27728,PI8.0,其氨基酸序列与 其他枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列有较高的同源性.纳豆激 酶的活性部位在Asp22,His64,Ser221,与底物结合部位在 Ser125,Leu64,Gly127.对纳豆激酶最敏感的底物是Ser—Ala— Ala—Pro,PNA,其次是His—Asp—Val,Leu—Lys—PNLJ. 2.2等电点,稳定性纳豆激酶的等电点为8.6?0.3,在
DH6.0,12.0情况下,其比较稳定,pH低于5.0时,则很不 稳定.4O?保温30min,酶活无损失,温度>5O?时活力逐 渐丧失,>6O?时则因蛋白变而迅速失活【3J.反复冻融对纳 豆激酶的活性影响不大.当纳豆激酶与煮沸过的小麦或大米 提取液,肉汤及血清蛋白和胃黏液蛋白混合后,其稳定性显着 提高,甚至在酸性条件下仍保持有酶活性_4J.说明纳豆激酶 在胃环境中能保持一定的活性,因此可El服来达到溶栓目的. 3药理作用
大多数溶栓药物,如链激酶,尿激酶,t—PA等都是纤溶
酶原激活剂型,均需通过激活靶酶,即纤维蛋白溶酶原(Plas— minogen)转变为纤维蛋白溶酶,再与纤维蛋白结合,发挥溶 栓作用,而其自身不能直接作用于纤维蛋白.纳豆激酶则不
然,它对纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感, 可直接将其水解成小肽和氨基酸.当把酶提取液滴加到纤维 蛋白平板上,短时间内即可出现透明的溶解圈,体外溶栓效果 显着.此外,将纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人 群的体内研究,表明其不仅可以抑制血栓的形成,还可迅速降 解纤维蛋白,增加纤维蛋白降解产物(FDP)的量,明显缩短血 浆中的优球蛋白的溶解时间(ELT),提高优球蛋白的纤溶活 性(EFA),并能降低PAl等纤溶酶原激活因子抑制子的活性, [J].江苏中医药,2004,25(2):57
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[收稿日期】2006—12—25
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ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2007Jul,16(19)
从而激活静脉内皮细胞,引起tPA的继发性增加,同时激 活尿激酶原(proUK)转变为尿激酶,使内源性纤溶酶量和 活性间接增强,具有双重功能.研究表明,纳豆激酶的溶栓效 果远大于纤溶酶和弹性蛋白酶,活性是纤溶酶的4倍.另 外张利等Z6]通过纳豆激酶纤维蛋白溶解活性实验,纳豆激酶 体内血栓溶解实验对纳豆激酶的溶栓作用做了较全面的研 究.体内血栓溶解的实验结果显示:纳豆激酶可明显延长血 栓形成时间,显着减少股动脉的长度及湿质量并明显提高血 栓的再通率,显着减少肺内血栓的形成,表明纳豆激酶具有较 强的体内溶栓作用,且同等剂量的纳豆激酶和尿激酶相比,前 者的溶栓作用高于后者.显示了纳豆激酶具有强大的溶栓作 用,且起效快,药效长.由于纳豆激酶的安全性,稳定性和良 好的溶解血栓的作用,其有可能作为口服试剂用于血栓的预 防和治疗,成为一代新的溶栓药物.
4生产
最初获得的纳豆激酶都是从传统方法生产的纳豆中提 取,但不适用于大规模生产.因此人们转而探索液体发酵生 产的方法.日本的方法液体培养的最适温度为28.5?左右, 超过32?几乎不显示活性;最适碳源为麦芽糖.付利等J的 研究结果显示,发酵后4d酶活性达到最大,最适碳源为木 糖,最适氮源是大豆蛋白胨,最适温度为37?.本实验室的 实验结果与黑龙江应用微生物所得结果基本相符,与日本的 研究有出入,可能是由于菌种不同所致.
另外还有报道,在培养基中添加海带提取液,可以促进 NK的生产.由于纳豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓
剂所无法比拟的优点,因此,人们渴望能将其开发为新一代的 溶栓剂.但从目前研究情况来看,纳豆激酶的产量还不高,难 以满足需要,故而要将其开发为实用的新型溶栓剂,提高纳豆 激酶的产量就变得非常关键.常用的提高纳豆激酶产量的途 径有3种:通过对野生菌种的筛选,诱变,挑选出产酶量高的 菌种;优化纳豆的发酵条件;通过基因工程技术改造纳豆激酶 的基因,得到产酶量高的工程菌.纳豆激酶作为微生物代谢 产物,只要有高活性的菌种,生产工艺条件成熟,就可实现大 规模生产,而且其发酵原料来源广,价格低廉,生产周期短,产 量高,且易于提取纯化,其开发应用前景十分广阔.
5与其他枯草杆菌蛋白酶的同源性比较
纳豆激酶同其他枯草杆菌蛋白酶具有很好的同源性,其 氨基酸序列同枯草杆菌蛋白酶E和枯草杆菌蛋白酶J比较而 言,分别仅有2个和4个氨基酸不同,纳豆激酶成熟区域的一 级结构同枯草杆菌蛋白酶E,枯草杆菌蛋白酶A分别具有 99.5%和99.3%的同源性.同其他枯草杆菌蛋白酶比较,纳 豆激酶表现出同枯草杆菌蛋白酶Carlsberg69%的同源性;同 枯草杆菌蛋白酶BPN有85%的同源性;与枯草杆菌蛋白酶 DY有70%的同源性,其同源序列都在氨基酸活性中心周围. 但乌赫特朗尼氏凝胶双向扩散实验表明在NK,BPN和Cads— berg之间没有交叉反应_9J.
6纳豆激酶的开发应用现状
目前,黑龙江省科学院应用微生物研究所已筛选出产纳 豆激酶活性高的菌株,探索出液体发酵罐生产纳豆激酶以及 分离提取纳豆激酶的生产工艺,并完成了对家兔动脉血栓溶 解作用试验,具有明显效果.同时上海医科大学分子遗传室 已经克隆了纳豆激酶基因,完成了DNA测序,并获得了纳豆 激酶的基因工程菌,表达量可达40%以上,建立了用工程菌 生产纳豆激酶的纯化工艺.纳豆激酶制剂恩开胶囊已处于中
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