转载自：器官移植
肝移植是治疗各类型终末期肝病的重要手段。得益于过去30年间免疫抑制剂应用的进展，肝移植患者获得良好的近期治疗效果。然而，近年来临床证据表明，包括肾功能损害、代谢综合征和原发病复发在内的免疫抑制剂相关不良反应，成为影响肝移植远期疗效的重要因素。供体特异性免疫耐受被认为是器官移植术后最理想的免疫状态，能够有效减少甚至摆脱免疫抑制剂的应用。肝脏是体内特殊的免疫赦免器官，免疫耐受研究在肝移植领域具有广阔的前景。本文总结了近年来肝移植免疫耐受的研究进展，并对今后研究的发展方向进行展望。
【关键词】 肝移植；免疫耐受；免疫抑制剂；排斥反应；不良反应；外周血单个核细胞；调节性T细胞；间充质干细胞
1967年，Thomas Starzl完成了世界上第1例肝移植术，被认为是医学史上重要的里程碑。经过数十年的不断探索，上世纪80年代以来，免疫抑制剂的发展，尤其是钙神经蛋白抑制剂环孢素和他克莫司的应用，使得移植物排斥反应发生率较前显著减少，肝移植手术取得了良好的近期、远期生存效果，从而被确立为治疗各类型急、慢性终末期肝病的有效手段。然而，肝移植患者的远期可预期生存寿命仍低于正常人群。目前认为，造成这一结果很大程度上归因于应用免疫抑制剂的远期并发症——现有免疫抑制剂的作用选择性不强，不可避免地造成受体免疫系统广泛性抑制，在减少移植器官排斥反应的同时，还会诱发感染和肿瘤；同时，免疫抑制剂的不良反应，包括肾功能损伤、糖尿病、心血管疾病、代谢综合征等，也是造成受体生活质量下降乃至死亡的重要原因。此外，现有的免疫抑制策略并不能有效防治慢性排斥反应，这也是导致晚期移植物失功的重要原因。由此可见，供体特异性免疫耐受能使受体减少甚至摆脱免疫抑制剂的使用，将极大地改善移植患者的远期预后，因而被认为是解决移植物排斥反应的“圣杯”。
1 移植免疫耐受的定义
移植免疫耐受的定义繁多且不统一。目前在临床较为普遍接受的概念是操作性免疫耐受，指免疫系统成熟的受者在没有免疫抑制剂作用下，不会对供者器官移植物进行免疫攻击的状态，又称为功能性免疫耐受。而当移植受者仅在低剂量免疫抑制剂维持治疗下，即可避免急性排斥反应和慢性移植物失功的状态称为几乎免疫耐受（又称为部分免疫耐受），目前认为这是免疫耐受诱导失败的一种特殊状态。自发性免疫耐受指在移植术后任何时期内未经过特殊的诱导手段而自发形成的免疫耐受状态。
2 自发性移植免疫耐受与免疫抑制剂停药
与其他实体脏器相比，肝脏不易发生排斥反应，需要的免疫抑制强度亦较低，是特殊的免疫豁免器官。目前认为，肝脏的这种免疫特点与其独特的免疫学微环境有关：一是肝脏有动脉和门静脉两套血供系统，其中门静脉系统接受来自胃肠道的血液回流，肝脏形成了一套行之有效的机制，以确保肝脏对来自胃肠道抗原的免疫耐受，因此，肝脏在一定程度上表现出“耐受”而非“排斥”的特性；二是微嵌合体的形成有利于诱导移植肝脏的免疫耐受；此外，越来越多的研究表明，淋巴细胞的激活诱导细胞死亡、肝脏未成熟树突状细胞和调节性T细胞（Treg）激活等机制也与肝脏特殊免疫耐受状态形成密切相关。
上世纪90年代，美国匹兹堡大学最早报道了自发性免疫耐受现象，他们发现一部分因无法耐受或依从免疫抑制剂治疗的肝移植病患可成功完全停用免疫抑制剂[1]。随后，其他的单中心研究也有类似的报道[2]。这一时期的研究结果表明，约20%的肝移植患者可以安全地彻底停用免疫抑制剂；而在没有成功停药的患者当中，有相当比例的人能够降低免疫抑制剂的使用量。另外，尽管临床资料显示急性排斥反应的发生率较前升高（12.0%~76.4%），但是排斥反应的程度较轻，可以通过调整免疫抑制剂得到有效控制，文献报道的因排斥反应导致移植物失功的案例罕见。这些早期研究数据提示，相当一部分术后稳定的肝移植患者处于“过度”免疫抑制状态。
于是，近期有多个前瞻性多中心随机队列研究进一步开展了对肝移植术后免疫抑制剂完全停药的研究。2012年，Feng等[3]招募了20例术后稳定的儿童活体肝移植患者进行了免疫抑制剂的停药试验，结果表明，高达60%的病例成功停药。进一步的研究分析提示，术后停药时机越晚（成功停药组的平均用药时间为术后100.6个月），达到操作性免疫耐受状态的可能性越高。而另一项关于102例成人肝移植的国际多中心研究结果表明，41.8%的随访超过5年的病例成功停用所有免疫抑制剂[4]。同样，多因素分析结果表明移植术后停药时机是影响停药成功率的重要因素（移植术后超过11年的患者停药成功率高达76%，而低于6年的病例成功率只有19%）。
越来越多的研究数据表明，在肝移植患者当中，能够达到免疫耐受状态的比例可能远高于我们的原有预期。研究者们寄希望于免疫抑制剂的停用能够减少相关并发症的发生，并减少移植患者的费用负担。然而，目前的研究尚存在一些问题亟需解决。首先，目前的研究样本大多排除了自身免疫性疾病患者和乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）阳性患者，而病毒性肝炎仍然是现阶段我国肝移植患者的主要原发病，停用免疫抑制剂在这些特殊人群是否安全有效尚不得而知；其次，目前的研究结果表明自发性免疫耐受的发生率随着移植术后时间推移而增加。但研究者们普遍的忧虑在于，免疫抑制剂不良反应造成的器官损害往往发生于术后早期而且为不可逆性，如何通过免疫监测早期识别“可耐受状态”，甚至通过人为干预措施诱导“免疫耐受”早期发生，是下一步的重要研究课题。
3 免疫耐受的临床监测和相关预测指标
如前所述，目前的临床研究结果表明自发性免疫耐受的发生与移植术后时间密切相关。一项尚未发表的前瞻性随机临床研究的早期数据表明，在18例术后第2年进行免疫抑制剂停药的肝移植患者中，只有2例成功停药。而随着移植术后时间的推移，一部分“排斥”倾向的患者会逐渐往“耐受”方向转变。因此，如何定期监测“免疫耐受”状态，在合适的节点选择停药时机，是现阶段重要的研究课题。为此，移植免疫学专家正在努力寻找能够反映机体“免疫耐受”状态的敏感指标，以筛选可能的自发性免疫耐受者。同时，免疫耐受生物学指标的研究也有助于我们更为深入地探究移植免疫耐受的形成机制。
目前研究较多、较深入的生物学指标为外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。Mazariegos等[5]报道，与正常人群和需免疫抑制的非耐受者相比，免疫耐受患者的PBMC样树突状细胞/浆细胞样树突状细胞（mDC/pDC）比例更高。另一些研究指出，免疫耐受受体的外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+T细胞计数更多，以及γδ1/γδ2T细胞比例增高[6-7]。这些初步的研究结果表明，与肾移植免疫耐受主要与B细胞相关不同，肝移植免疫耐受形成的机制可能与自然杀伤（natural killer，NK）细胞和T细胞关系更加紧密。
近年来兴起的各类新型检测技术为临床高通量检测提供了可能，大大提高了免疫耐受生物学指标的研究进展。通过对耐受和非耐受病例的PBMC标本进行寡义核苷酸芯片检测，Martinez-Llordella等发现一些基因在外周γδT细胞和NK细胞当中高表达，进一步的研究从13个基因中筛选出3个基因组合，对区分耐受和非耐受患者有着惊人的准确率，文章提到其错误率只有13%~17%[8]。然而，该研究采用了回顾性设计，并且没有提供移植肝的病理资料，使得研究结果的说服力打了折扣。随后不久，Bohne等报道了首个前瞻性研究，并且分析了外周血和移植肝的病理资料。该研究发现，耐受组和非耐受组移植肝的基因转录产物存在显著差异，同时，移植肝和外周血的基因转录产物并不重合。因此，研究者认为移植肝本身的免疫特性比外周血对机体免疫耐受状态更具代表性。研究还发现肝内与铁代谢平衡相关的基因与免疫耐受状态相关，证明铁代谢可能参与调节机体对移植肝的免疫反应。
总体而言，目前临床上缺乏敏感的生物学指标供移植学家判断机体的免疫状态，从而难以选择正确的停药时机。因此，未来对于新的生物学指标的探索需求十分迫切。不断发展的各类型高通量检测技术能够为下一阶段研究提供很好的武器，蛋白组学、代谢组学和转录组学等学科与移植免疫的交叉应用也许能为我们在不久的将来筛选出更合适的生物学指标，从而建立移植免疫耐受的生物标记物指纹谱（biomarker signatureprofiles）。此外，目前生物学指标的来源主要为两类，一种是外周血液，另一种是肝脏病理活组织检查（活检）标本。目前主流观点认为肝脏本身的免疫病理状态能更准确地反映机体对移植物的“免疫接受状态”，但是肝脏病理活检为有创性检查，存在一系列的并发症和禁忌证。未来如何平衡肝脏穿刺风险和免疫监测获益，也需要进一步的临床数据验证。
4 移植免疫耐受诱导方法
自发性免疫耐受大多发生在术后较长的时期后，而目前研究表明，免疫抑制剂的不良反应，例如钙神经蛋白抑制剂对肾功能的损伤，主要发生在移植术后早期，而且这种损伤可能为不可逆性。因此，除了进行机体免疫监测、尽早识别免疫耐受人群，对术后移植患者进行人为干预，诱导免疫耐受状态提前形成，是减少免疫抑制剂使用的另一种策略。目前肝移植免疫耐受诱导方法主要有以下几种，大部分尚处于临床试验或动物实验阶段。
异基因造血干细胞移植后形成嵌合体为目前免疫耐受诱导的主要方法。稳定的嵌合体建立后，能有效诱导形成供体特异性的永久性免疫耐受，是目前最有效的免疫诱导方法，也是唯一在各种实体脏器移植中都证明有效的方法。然而，非血液病患者移植术前进行清髓性异基因干细胞移植有巨大的伦理障碍，因此移植免疫学专家一直在探索非清髓性体系的可能性。然而，早期的实验证明非清髓性干细胞移植诱导效果不佳。除此之外，肝移植患者术前可能合并三系血液细胞减少、凝血功能障碍、严重感染等复杂情况，尸肝移植手术时间存在随机性，术中可能出现大量出血或血制品输注，这些因素客观上限制了干细胞移植构建嵌合体策略在临床的实际应用。目前对这一策略的研究主要为单中心的小样本研究，临床上尚未形成统一有效的嵌合体构建体系。
Calne[9]提出了的另一种免疫耐受诱导策略——移植术前应用淋巴细胞消除剂消除可能对供体来源产生活化的淋巴细胞，术后停用或仅以低剂量的免疫排斥药物维持。目前使用的淋巴细胞消除剂主要为单克隆抗体，包括阿来组单抗（Campath1H）。这一策略在肾移植领域取得了一定程度的成功，但是移植患者术后并不能成功诱导完全免疫耐受，需以低剂量免疫抑制剂抑制记忆性T细胞活化。然而，目前有3个的临床试验检验该策略应用于肝移植患者的效果，均出现了较高的排斥反应发生率[10-12]。
近年来兴起的另1种免疫耐受诱导策略即细胞治疗。其中，Treg治疗具有巨大的临床应用前景。一项基础研究表明，在体外CD80和CD86共刺激阻断条件下对受体淋巴细胞和受照射供体来源淋巴细胞进行共培养，成品回输入灵长类肾移植动物模型，可成功诱导免疫耐受。一项来自日本的研究团队对10例活体肝移植受体针对这项研究策略进行了临床试验，研究团队于2015年在布鲁塞尔的欧洲肝移植协会年会上报道了初步结果，共有7例成功实现了术后早期停药。与此同时，尚有两项临床试验（NCT02188719和NCT02474199）正在进行之中，关于Treg的研究结果有待进一步跟进。此外，既往文献报道间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）能够促进Treg功能，同时抑制效应性T细胞，也是诱导器官移植免疫耐受的理想靶点之一。动物实验证明MSC能够诱导Treg介导的特异性耐受。目前关于MSC诱导免疫耐受仅有的临床资料主要来自活体肾移植。一项中国的单中心随机试验对比了使用MSC和巴利昔单抗的免疫诱导效能，术后随访1年发现MSC治疗能够减少免疫抑制剂的使用，同时减少急性排斥反应的发生（术后6个月）[13]。关于MSC的诱导效能和安全性尚需更多实验数据的评估。
5 总结
供体特异性的免疫耐受是一劳永逸解决移植排斥的终极方法。免疫耐受一方面能够有效防止免疫排斥造成的移植物丢失，另一方面能够有效减少免疫抑制剂使用，减少相关的肾功能损伤、代谢综合征、感染等并发症发生。目前研究表明，相当一部分肝移植患者术后能够形成自发性免疫耐受，但目前临床上缺乏准确的免疫监测及筛选指标。如何准确评估受体发生免疫“排斥”向免疫“耐受”的转变时机，筛选潜在的停药人群，是下一阶段的重要研究方向。而目前主动诱导免疫耐受的策略并不成熟，临床上缺乏统一有效的嵌合体构建体系，未来的应用仍需进一步研究。以Treg和MSC为代表的细胞治疗则为免疫耐受诱导提供了新思路，具有广阔的研究前景。
参考文献：略
作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院器官移植中心广东省器官移植研究中心 中山大学器官移植研究所
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