让镜中世界不再黑白，电子显微镜的全新显像技术—《科学月刊》

电子显微镜的世界只有黑白？

显微镜的发明，让我们得以观察人眼难以分辨的微小世界。光学显微镜以可见光成像，好处是可以利用不同颜色的染剂让组织不同结构呈现不同颜色，人眼容易判别；缺点则是解像力有限，小于 0.2 微米的构造，细节难以清楚在显微镜下呈现。电子显微镜以电子成像，好处是解像力至少比光学显微镜好上 1000 倍，奈米等级的构造能清晰辨识；缺点则是电子显微镜下的世界只有黑白。

光学显微镜以可见光成像，好处是可以利用不同颜色的染剂让组织不同结构呈现不同颜色，让人眼容易判别。图／Pinterest

电子显微镜下的花粉。source：wikimedia

因为利用电子成像，偏偏人眼无法接收电子讯号，于是电子显微镜的设计中，需要将电子讯号转换成人眼可接收的光讯号，我们才能观察到样本在电子束照射下呈现出来的影像。只是，电子讯号转换成光讯号时，单纯以光强度显示差异：较多电子讯号的地方较亮，较少电子讯号的地方较暗，也因此，影像通常以灰阶、也就是黑白的方式呈现。

黑白与彩色影像在细胞或胞器形态的研究上或许没有太大的差别，例如：双凹圆盘状的红血球不会因为颜色不同而呈现不同形状。然而，光学显微镜的一大利器是可以配合不同颜色染剂的使用，藉由色彩的辅助使得不同构造间的区别变得容易许多，同时也使得光学显微镜下的世界缤纷多彩。

近年来荧光蛋白的发现与改良，更增添了光学显微镜应用的广度与深度。例如：利用免疫荧光技术标定细胞内特定的分子，或将特定蛋白质基因序列前加上荧光蛋白的序列，不止能观察蛋白质在细胞内分布的情形，甚至还能以荧光追踪该蛋白质的动态。尤其荧光染剂有多种不同颜色，使我们得以在同一切片下同时标定，并观察多种带有不同色彩讯号的蛋白质。

电子显微镜虽然有较高的解像力，但是无法输出彩色影像。图／生物型穿透式及扫描式电子显微镜，清华大学贵重仪器中心

鱼与熊掌能否兼得？

然而，光学显微镜的解像力有限，即使有了荧光的辅助，很多时候还是必须借助电子显微镜，才能厘清发出荧光的区域到底有什么细微结构，或发生什么变化。「如果电子显微镜能像光学显微镜那样，可以同时观察、分别出不同的荧光，那该有多好！」这是许多研究人员都曾有的愿望，虽然大家也都清楚电子显微镜下看不到可见光的颜色，切片虽然也可透过染色增加对比，但染的是重金属染剂，藉由蛋白质或核酸等物质与重金属结合后，产生深染黑灰色的电子致密区（electron-dense），以便和背景等淡染灰白色的电子透明区（electron-lucent）做区隔。

2016 年去世的钱永健博士以他在荧光蛋白的研发及对相关领域的重要贡献，于 2008 年获得了诺贝尔化学奖，他的研究团队除了扩增荧光在不同技术的应用上，也试图找出能在电子显微镜下观察荧光的方式，目的除了希望以高解像力的电子显微镜进一步确认光学显微镜下的发现，更希望能使电子显微镜下的影像也呈现不同颜色，使研究人员能更加清楚的辨识不同结构。

马兰托（Robert Maranto）是第一个成功在电子显微镜下观察到荧光分子的科学家。早在 1982 年，他率先在光学显微镜下观察注射了荧光黄（Lucifer yellow）染剂的神经细胞，接着将切片浸泡在含二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）的溶液中，并以蓝光照射切片，被激发的荧光黄分子释出自由基促使 DAB 氧化，由于氧化的 DAB 形成的沉淀物可以与重金属锇酸结合，因此成功在电子显微镜下看到原本荧光黄所在区域出现许多电子致密的沉淀物。

依据此原理，包含钱永健博士在内的许多研究团队在接下来的数年间不断改良此技术，于是有了分子更小、更容易注射到细胞内的荧光染剂；也开发出光氧化后能产生更多沉淀物的荧光染剂等，使荧光转换成电子致密沉淀物的效率更好，间接达成在电子显微镜下观察荧光的愿望。

传统的电子显微镜在将电子讯号转换成光讯号时，单纯以光强度显示差异：较多电子讯号的地方较亮，较少电子讯号的地方较暗，也因此，影像通常以灰阶、也就是黑白的方式呈现。图／wormbook.org

新技术遇上的困难

可是，不同颜色的荧光在转换成电子致密沉淀物后，基本上全变成黑色，无法区别。前面提过，光学显微镜的一大优势是能在同一切片上，以不同荧光颜色区别不同分子或构造，这在电子显微镜下相对困难。虽然在电子显微镜下也有办法标定及观察特定分子，利用免疫标定，使带有黄金颗粒的抗体与标定分子结合上，因为黄金颗粒电子密度高，容易在电子显微镜下观察到，加上可以选择特定不同大小的黄金颗粒，所以要同时在一片切片上标定两种以上分子，技术上也是可行的。

然而，携带黄金颗粒的抗体分子较大，在已固定的细胞或组织间渗透效果不好，限制了使用的范围。虽然这问题可以改用上述氧化 DAB 产生电子致密产物的方式解决，也就是让抗体带有可氧化 DAB 的染剂或酵素，或是直接以基因转殖方式，使欲观察的蛋白质与荧光蛋白结合，这些方法解决了大分子不易渗透的问题，但是原来电子显微镜下的影像就是黑白，沉积的产物也是黑色，反而增加了辨识的难度。

替细胞「染色」的新解答— 镧系元素

去（2016）年 11 月由钱永健博士研究团队发表在 Cell Chemical Biology 的文章，则提供了解决方式。研究团队合成了带有特定镧系元素的 DAB，如镧–DAB、铈–DAB、镨–DAB 等，以专一性荧光染剂渗透或基因转殖方式，让欲观察的细胞内结构或蛋白质带有不同的荧光，接着在荧光显微镜下，先激发第一种荧光，加入第一种带镧系元素的 DAB，使沉淀产物中有第一种镧系元素；适当的去除未反应物后，再激发第二种荧光，加入第二种带镧系元素的 DAB，使沉淀物中有第二种镧系元素沉积。

反应后的切片依电子显微镜样本制备方式处理后，在一般穿透式电子显微镜下，可以观察细胞内细微的各式结构，但此时不管何种带镧系元素的 DAB 产物，在显微镜下还是不容易和其他深染构造区分。作者接着以加装了「电子能量损失能谱仪（Electron energy loss spectroscopy, EELS）」的电子显微镜观察样本，分析切片中两种镧系元素讯号分别出自何处，得到两种元素的分布图，最后将传统电子显微镜影像与两种镧系元素分布图于绘图软件中重叠在一起，并为元素分布图套色，使各自带有不同颜色，如绿色代表镧，红色代表铈，于是得到黑白的电子显微镜照片上有绿色和红色等色彩的呈现。

以镧系重金属替电子显微镜下的细胞「染色」的示意图。图／MRSBulletin

作者选择镧系元素有几个原因，一是他们都是重金属，在 EELS 元素分析下讯号容易辨识，另一个则是在 DAB 氧化时易一起形成沉淀且不易流失。严格说来，作者并非直接在电子显微镜下看到彩色的影像，毕竟成像的还是电子，不是光子。不过本篇文章采用的技术，让我们可以先利用光学显微镜及荧光蛋白科技等优势，观察大范围组织获得较整体的概念，再藉由电子显微镜的高分辨率了解奈米层级的结构，同时对标定的分子在细胞内的分布状况或交互作用，能藉由颜色的呈现更清楚的与背景影像区别，这对未来细胞显微结构及分子分布与功能的研究开启了另一种可能性。