活细胞中并不是每个过程都在持续着进行，为了控制细胞的生长和分裂，以及对细胞外信号的应答，它们中的许多过程必须在“开”和“关”的状态间循环，例如视觉信号传导、膜转运、蛋白质合成中多肽链的延伸等，这些过程必须在精确的状态下被“开”和“关”，这就离不开一套特殊的、起分子开关作用的蛋白质的调节，而蛋白质构象的变化就是这种开关功能的基础，因此，深入了解蛋白质的构象调节过程对于研究生物体内蛋白质的功能至关重要。
蛋白质从头设计，由于其可以根据研究需要，完全从头设计全新的蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期功能，而成为蛋白质功能研究过程中新兴的关键技术（详见BioArt报道：Nature亮点丨David Baker让蛋白质从头设计“飞入寻常百姓家”）。近些年来，基于蛋白质折叠到最低自由能状态的原则，在从头设计稳定的蛋白质结构方面已经取得了相当大的进展，这些努力主要集中在最大化所需结构和所有其他结构之间的自由能隙，并且产生了各种不同的唯一的稳定蛋白【1,2】。但是，设计可以构象调节的开关蛋白一直以来都是一个巨大挑战，因为多种状态下的蛋白质必须具有与未折叠状态相关的足够低的自由能，而且不同状态之间的自由能差异必须足够小，以至于蛋白质在受到特定外界条件时可以自由切换开关状态。因此，实现从头设计一个模块化的、可调节的蛋白质系统用以在外部诱导存在时调节蛋白质的构象状态是一个重要且有实际应用价值的课题。
2019年7月25日，来自美国华盛顿大学的David Baker团队在Nature上在线发表题为De novo design of bioactive protein switches的文章，成功设计出可以通过诱导构象改变来调节其功能的开关蛋白质，这是蛋白从头设计领域的又一里程碑，为合成生物学和细胞工程开辟了新的道路。
开关蛋白质系统的从头设计应该遵循以下两个原则：1.因为大多数残基水平的相互作用可以是相似的，所以在一个由同一位置的分子间竞争和分子内竞争控制的系统中，两个状态之间的编程自由能差异应该比远程位点的变构激活更直接。2.一个具有可用于竞争性相互作用的扩展结合面的稳定的蛋白质框架，比仅在结合后才被排序的框架更容易编程且脱靶相互作用更低。基于这两个特点，本文的研究人员建立了一个开关蛋白的抽象模型（图1），该模型由一个“笼子”（蓝绿色）和带有功能基序（橙色）的“门闩”（蓝色）组成，在关闭状态时，由于分子间相互作用，“笼子”和“门闩”结合，当外源加入与“笼子”结合更紧密的“钥匙”（绿色）时，两者打开，释放“门闩”表明结合位点，使之与靶点（黄色）结合，产生功能。而这样一个动态过程是由每个反应的结合平衡常数来控制的。
图1 开关蛋白质抽象模式图
基于上述原则思路，研究人员选择了能够在广泛动态范围内调整“笼子-门闩”和“笼子-钥匙”相互作用的密切关系的结构特征——螺旋结构，从头设计出开关蛋白质的结构系统，即静息状态时的5-螺旋结构（笼子），其单一界面或者可以与末端螺旋结构（门闩）通过分子内作用结合，或者与一个肽段（钥匙）通过分子间作用结合，从而产生开关的效果，开关蛋白（switch）和诱导蛋白（钥匙）共同被称为LOCKR（latching orthogonal cage-key proteins）。
本文的研究者认为，在 “门闩”结构中嵌入一段功能肽段，在外源“钥匙”与“笼子”结合以释放“门闩”之前，其功能一直处于失活状态，而通过调整热力学参数可以调节其激活。为了证实LOCKR的实际功能，研究人员改变“笼子”和“门闩”上的功能基序，首先设计BimSwitch，以模拟调控凋亡的关键的Bim-Bcl2相互作用，以促凋亡多肽Bim为“笼子”，实验证实，“钥匙”的加入成功激活了两者的相互作用超过40倍，这与大多数自然存在的蛋白相互作用程度相当甚至更高。随后，研究者在活细胞内通过将cODC降解决定子（degron）设计为“笼子”，设计degronSwitch，把开关蛋白的激活与蛋白质的降解过程相偶联，成功地诱导了活细胞内目标蛋白的降解。最后，以核输出序列为“笼子”设计nesSwitch，“钥匙”的分子间作用成功调控活细胞内蛋白质的定位。
以上实验结果表明，根据不同的功能肽段基序设计不同的LOCKR，其在活细胞中均能表现出较好的功能，进而突出显示了LOCKR的模块化和可应用性。基于LOCKR的设计成功，同一天，David Baker团队在Nature上再发一篇题为Modular and tunable biological feedback control using a de novo protein switch的文章，利用degronLOCKR开关自如的特点，实现了在活细胞内的内源性信号通路和合成基因回路的反馈调节，这一工作是有助于实现合成生物学全部潜能的又一重要里程碑。
首先，研究人员通过将degronLOCKR与内源性信号分子融合，在酵母MAPK交配通路中产生了合成的负反馈和正反馈调节（图2），表明这个策略可以用来重塑复杂的内源性信号通路。紧接着，研究者们在一个合成基因回路上评估degronLOCKR介导的反馈调控，以量化反馈控制电路的反馈能力和工作范围。以此表明，degronLOCKR蛋白的设计本质使得通过简单而合理的修改就能调节合成回路和交配通路中的反馈行为。
图2 degronLOCKR实现合成反馈调控
综上所述，可调且泛化的蛋白质开关的设计是蛋白质从头设计的一个重要进展。在开关控制的LOCKR系统中，一个设计的“钥匙”的加入可以诱导相应“笼子”构象的巨大改变，从而释放蛋白质功能。与天然的调节系统相比，LOCKR系统具有以下优点：1. LOCKR是一个非常通用的平台，可以在任意情况下对功能进行封闭和激活，从高亲和力蛋白质-蛋白质相互作用的诱导激活到附着货物的受控降解或定位。2.对于任何功能模式，许多被载物都可以被调节，并不局限于文中提到的几种。LOCKR的应用范围有待深入开发。与此同时，David Baker团队的这项工作更深入地证明了蛋白质从头设计用于产生在细胞中实现复杂合成和调节功能以应用于生物技术和治疗中的巨大潜力和未开发的潜力。
参考文献
1. Huang, P.-S., Boyken, S. E. & Baker, D. The coming of age of de novo protein design. Nature 537, 320–327 (2016).
2. Huang, P.-S. et al. High thermodynamic stability of parametrically designed helical bundles. Science 346, 481–485 (2014).
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1432-8
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1432-7
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