Armstrong：双特异性抗体

近年来，双特异性抗体有一个明显的井喷趋势，实质上是靶点协同设计伴随着肿瘤免疫而兴起。国内的双特异性抗体更多地是一种Fast Follow的竞争环境，本文主要梳理双抗的研发格局。理解双抗的逻辑有两个层面：技术平台、靶点组合。其中技术平台一度是重要的一环，然而随着技术的进步靶点组合背后的机制探索才是更重要的因素。

技术平台

关于双抗技术，已经有许多综述文章进行罗列。最早的双抗设计思路很直接，因为抗体是二对称的，将两个半抗体组合即可形成双特异性抗体。由此，早期的双抗设计集中在促进异源重链的形成。从理化性质上，大概可以归类为基于空间位阻的KiH等和基于电荷ART-Ig等双抗技术平台。至于轻链的匹配问题，可以采用共同轻链或者另一层匹配设计。这些工程化的改造构成了非对称双抗技术的核心，也是各生物技术公司专利保护的核心。

基于电荷的设计灵活性更强，因此很多生物技术公司根据类似原理开发了双特异性抗体技术。不过考虑到两条链相互作用的氨基酸总归是比较保守，因此不同技术平台在改造专利中氨基酸突变保护的覆盖范围上会有一些overlap。

非对称双抗的不同设计还有Duobody，通过405、409位氨基酸突变促进Fab exchange形成双抗，表达时两个单抗分别表达，体外构建双抗。

另外一个独特设计的非对称双抗包括再生元的双抗技术思路稍显不同，基于改造后的重链不再结合Protein A，从而通过Protein A的pH梯度纯化来得到双抗。

韩美的Pentambody是在CH3引入突变，促进异源二聚体之间形成氢键。凡恩世2019年9月与韩美达成合作，开发双抗和多抗。

国内的双抗技术平台总体上与前述相符，如康宁杰瑞CRIB、爱思迈的Exmab双抗技术（下图）均基于电荷来促进异源二聚体重链的形成，与ART-Ig等基于电荷的双抗技术类似。

国内也诞生了一些独具特色的双抗技术，包括药明生物的Wuxibody等。药明生物的Wuxibody是一种对称的双抗技术，形式上市Fab串联至第一个抗体的重链N端（类似于Crossmab、岸迈生物FIT-Ig等，此类双抗分子量大，为250kD左右），其技术核心是通过TCR的恒定区替换Fab的恒定区，避免轻链的错配。

药明生物Wuxibody目前已达成多项授权合作协议。

对称双抗的工程化改造相对简单，如中山康方的Tetrabody技术（下图为PD-1/CTLA-4双抗AK104）。其中很多双抗技术采用的实际上是类似于基于抗体融合蛋白。即在轻链或重链的N端或C端融合另一domain，可以是细胞因子、scFv、纳米抗体等。这类双抗在表达和纯化上都与单抗完全相同。

很多双抗实际上应用了类似的设计。如翰思生物的PD-1/CD47双抗（PD-1抗体与SIRPα融合）、比洋生物PD-1抗体-CD80融合蛋白、信达生物OX40抗体-PD-L1纳米抗体融合蛋白、普米斯生物基于纳米抗体的PD-L1/TGF-β双抗等。

如果两个抗体部分都采用单链的纳米抗体或scFv，双抗的形式更为简单。典型的如安进的BiTE（2个scFv串联）、Numab的兔双抗MATCH技术、Ablynx的纳米双抗、Harpoon的TriTAC技术（一个scFv和一个纳米抗体串联）。在半衰期方面，安进二代BiTE技术在2个scFv基础上再串联一个Fc且其两条链也采取首尾相连（整体仍是单链），Numab串联一个抗HSA的兔scFv、Ablynx再串联一个抗HSA的纳米抗体，Harpoon再串联一个抗HSA的纳米抗体。其中Numab、Ablynx、Harpoon由于都采用抗白蛋白的单链抗体结构域，因此整体分子量都很小且无糖基化，表达上也可以采用微生物表达。如Ablynx采用毕赤酵母表达。

类似的，康宁杰瑞PD-L1/CTLA-4双抗KN046即抗PD-L1和抗CTLA-4的两个纳米抗体串联至Fc。和安进二代BiTE区别在于Fc为双链，每条重链串联PD-L1纳米抗体和CTLA-4纳米抗体，为二对称四价抗体。

和铂医药（HCAb）和百奥赛图（RenNano）的重链抗体在结构上类似于纳米抗体，构建双抗时与上述结构类似。

洛启生物开发的PD-L1/4-1BB纳米双抗与上述结构类似。

传奇生物等将串联的纳米抗体用于构建双特异性的CAR-T细胞疗法，如传奇生物构建的靶向CD19/CD20的双特异性CAR-T疗法。

除了纳米双抗或者scFv双抗，一些类抗体也采取类似的架构。如前几天创响生物引进Affibody公司的ABY-035，即为靶向IL-17的二价类抗体。其中ABD为结合白蛋白的affibody结构域，起到延长半衰期（类似Fc的作用）的效果。Z1、Z2不同时即为双特异性Affibody，如在开发的HER2/HER3 双特异性Affibody。

靶点组合

除了双抗形式实现依靠的技术之外，更重要的问题依然是靶点本身的组合问题。以CD3、CD16为基础的双抗本质上是募集T细胞或NK细胞杀伤靶细胞，由于其中一个靶点已经锁定，因而该类双抗在机制探索中积累了一些经验。肿瘤免疫的兴起则带动双抗形成新一轮的井喷趋势，尤以PD-1或PD-L1为基础寻找具有协同效应的双抗靶点为最。

协同效应

HER2双表位的协同效应已经被罗氏Herceptin、Perjeta联用所证实，康宁杰瑞、天广实等开发了HER2双表位的双抗，百济神州则引进了Zymeworks的HER2双表位双抗ZW25和ADC双抗ZW49。

AMD等眼病继VEGF之后阻断多条血管增生通路的多特异性治疗（抗体或融合蛋白）成为新的热点，PDGF靶点失败之后，罗氏正在开发VEGF/Ang2双抗Faricimab（下图），信达生物开发VEGF/CFD融合蛋白等。再如自身免疫病中，百时美施贵宝开发IL-17A/IL-23，礼来开发IL-17/TNFα双抗等，设计思路都是希望通过阻断不同的炎症通路可以达到协同效应的目的。

CD3双抗

不论是PD-1抗体为代表的免疫检验点抑制剂、还是CAR-T等，T细胞都是一个治疗的核心。但CD3双抗一个很重要的问题是正常组织过度激活T细胞有很强的毒性，因而CD3双抗的发展经历了一些波折。不同的生物技术公司在CD3抗体的选择和具体设计上都形成了独有的技术平台，尽量平衡有效性与安全性。如纪念斯隆凯瑟琳中心发现抗CD3的scFv镕和达轻链C端的抗肿瘤活性更强。

安进二代BiTE将Fc两条链首尾相连串联到2个scFv上，可以更好的保证CD3抗体依赖于另外一个肿瘤靶点的结合再激活T细胞。

由于表位、亲和力、寡聚化、FcγR依赖的cross-linking等都会影响双抗的有效性和安全性，上述的规律并不能简单推广于其他CD3双抗。但这些发现为后来者提供了一些重要的参考。

另外一种解决思路是引进肿瘤微环境条件激活的技术到有类似毒性问题的双抗中，以更好的平衡安全性与有效性的问题。如安斯泰来引进Cytomx的Probody技术，开发CD3双抗。

中外制药开发了高浓度ATP（肿瘤微环境特异）以来的双抗技术，保证在肿瘤微环境才能特异性结合抗原。

共刺激双抗：CD28双抗和4-1BB双抗

去年以来，赛诺菲CD38/CD3/CD28三特异性抗体，再生元CD28共刺激双抗，中外制药4-1BB共刺激双抗增强CD3双抗疗效相继进入视野。这些双抗或多特性抗体的原理类似于CAR-T，即通过选用低亲和力的CD3抗体保证安全性，同时通过CD28抗体或4-1BB抗体增强肿瘤微环境中肿瘤细胞靶点结合后T细胞的激活。也就是同时解决安全性和有效性的问题。

PD-L1/4-1BB双抗也有类似的问题，因为4-1BB抗体本身有毒性问题，因此双抗设计上强调PD-L1结合以来的4-1BB激活。基石药业（引进Numab的ND021，如下图）、科望生物（引进Inhibrx的Inbrx-105）、维立志博、洛启生物（纳米双抗）等都强调类似的作用机制。此次AACR披露F-Star的PD-L1/4-1BB双抗强调4-1BB的激活依赖于PD-L1介导的cross-linking。当然，艾伯维今年2月Molecular Cancer Therapeutics期刊上发表的文章，已经证实FcγR依赖的Cross-linking和结合表位是降低4-1BB单抗肝毒性和提高抗肿瘤活性的关键。也就是说通过单抗结合表位/Cross-linking的优化，或者双抗的第二靶点（PD-L1介导）的设计，都有可能改善4-1BB靶点的安全性并提高抗肿瘤活性。

围绕NK细胞的三特异性抗体

类似于赛诺菲基于T细胞的TAA/CD28/CD3三特异性抗体，Innate Pharma开发了基于NK细胞的TAA/CD 16/NKp46三特异性抗体NKCE技术，以更好的募集和激活NK细胞，杀伤肿瘤细胞。

类似的技术还有Dragonfly Therapeutics开发的TriNKET技术，为TAA/CD16/NKG2D三特异性抗体。也就是说，在TAA/CD16传统双抗基础上，Dragonfly引入了NKG2D、Innate Pharma引入了NKp46来更好的激活NK细胞。Innate Pharma背靠阿斯利康开展多项合作，Dragonfly则背靠新基（如今是百时美施贵宝）开展多项合作。

此外，有国内企业如百利药业开发了四特异性抗体技术GNC，架构为scFv串联的TAA/CD3/4-1BB/PD-L1。细节可见参考文章，此处不做评论。

抗体-细胞因子融合蛋白

PD-1等免疫检验点之后，肿瘤免疫目前的竞争焦点在于更好的激活免疫系统，以提高PD-1抗体等的响应率。简单说，就是多机制变冷肿瘤为热肿瘤，提高治疗效果。

在这之中，细胞因子IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、TGF-β等被广泛尝试用于提高PD-1抗体等的响应率和疗效。除了联合治疗，抗体-细胞因子融合蛋白成为一种重要的方式。

PD-L1/TGF-β融合蛋白M7824大火之后，恒瑞医药SHR-1701、普米斯生物PM8001、创胜集团等都在跟踪开发。除此之外，IL-2、IL-7、IL-15、SIRPα也有国内生物技术公司用于构建抗体-细胞因子融合蛋白。

此外，TLR8抑制剂近年来也被初步证实可以提高免疫检验点抗体药物的疗效。Silverback即致力于开发抗体-TLR8抑制剂的ImmunoTAC技术平台，由于TLR8抑制剂为小分子，因此整个分子形式上类似于ADC，但作用机制上类似于抗体融合蛋白或双抗。

小编总结

双抗领域诞生了很多技术平台，当下已经进入了深水区，靶点组合背后的机制探索成为核心。相对应地，一些靶点组合逐渐杀出重围，尤其是CD3双抗日渐成熟。如血液瘤方面，CD3/CD20双抗对于一些CD19 CAR-T治疗抵抗的患者仍有疗效，2019年ASH会议上5家药企的CD3/CD20双抗披露积极数据。多发性骨髓瘤，BCMA/CD3双抗也成为研发热点。

免疫检验点有很大的组合空间，但真正找到有协同效应的双抗靶点组合及合理设计并不容易。如中山康方PD-1/CTLA-4联合化疗胃癌治疗取得积极数据，但响应率与PD-1抗体联合化疗似乎差不多（非头对头对比）。此次AACR葛兰素史克OX40抗体联合PD-1抗体Keytruda则未表现出协同作用。

总体来看，国内的双抗研发涌现一些具有特色的技术平台。靶点组合方面的创新则远远少于平台创新，几乎所有的双抗项目在靶点方面都跟踪国外（同样的靶点组合或有联用治疗的背景），如PD-L1/TGFβ即至少有3家药企跟踪。在小编看来，国内的双抗研发以fast follow为主，如恒瑞在PD-L1/TGFβ、PD-1与IL-15联用等仍然走在最前的位置上。这也符合国内生物医药的大环境，控药价与可负担是最重要的。Fast follow是风险小、成本可控的模式，本质上仍是商业逻辑。中国生物医药近十年的变迁，fast follow是第一要义，只不过follow的对象从化学仿制药到生物类似药，再到同靶点单抗，再到同组合双抗。在这种背景下，速度和效率最重要，创新更多体现在差异化以求得细分市场和卖点。