要想知道什么是RNAseq，首先我们来看一下RNA-seq的实验流程：
上图中，大家最熟悉的还是mRNA-seq。它是目前高通量测序技术中被用得最广的一种技术。我们都知道，total RNA中95%以上都是核糖体RNA，而rRNA在整个人类当中都是非常保守的，而且在人的各个组织器官当中也是极度稳定的。也就是说，rRNA并不能为我们实验者提供什么有用的信息，只占total RNA总量2%-3%的mRNA才是RNA当中信息含量最丰富的那个部分，是人们在科学研究中主要的关注点。这也是mRNA-seq被广泛应用的原因。
mRNA-seq可以帮助我们了解：各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。
比如，对照组和处理组之间的基因表达差异；处理不同时间点之间的基因表达差异等等；正常组织和肿瘤组织之间的转录组表达差异等等。
mRNA-seq的测序方法有很多，其中Illumina的TruseqRNA是最受欢迎的。今天就以它为例跟大家介绍一下mRNA-seq的建库及测序原理。
第一步当然是抽提总RNA，抽提方法此处不详细展开。但值得一提的是，TruseqRNA对于mRNA的完整度要求很高，总RNA一定要质检合格才能继续建库。这是因为，TruseqRNA是通过mRNA具有poly(A)尾这一特点，用带有Poly(T)探针的磁珠从total RNA中钓取mRNA，如果mRNA有降解的情况，那么磁珠所吸附下来的片段，都是那些靠近3'端的那些片段，5'端降解的片段会在富集过程中被洗脱掉，建库得不到完整mRNA的序列，后续数据分析会发生偏差。
RNA可以用安捷伦生物分析仪（Agilent 2100）进行质检。降解的RNA在电泳时会在低分子量的条带位置上呈现弥散状。完整的RNA具有明显的理想条带，可分为28S，18S，5S；28S和18S峰比较锋利；28S条带亮度为18S的1-2倍，5S一般很弱甚至没有。Agilent 2100会根据28S和18S峰的高度和尖度进行打分，称为RIN值。Illumina公司推荐用RIN值在8.0以上的RNA进行建库和测序。下图是一个质量较高的total RNA质检图。
RNA质量过关后，可以进行正式的建库。
建库原理
首先，要钓取mRNA。TruseqRNA利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点，用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交。Poly(T)探针就和带Poly(A)尾巴的mRNA结合在一起，接着回收磁珠，再把这些带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。洗脱下来的mRNA用镁离子溶液进行处理，镁离子会把mRNA打断成180-200bp的小片段。被打断的这些mRNA片段，用随机引物进行逆转录。先逆转录出第一链，再合成第二链。逆转录出双链的cDNA后，在cDNA两端接上“Y”型的接头（接头上有index序列；多个样品可通过加不同的index的接头，在后续测序中被区分开），再经过PCR扩增，就成了标准的测序文库，可以到HiSeq测序仪上进行测序了。
测序原理
HiSeq X Ten是Illumina公司2014年推出的测序系统，也是是目前全球使用量最大的第二代测序机器。它采用的是边合成边测序的策略，测序读长为2×150 bp。测序时，稀释至上机浓度并变性成单链的文库加至流动池（flowcell）中。文库DNA在通过flowcell的时候会随机附着在其表面的通道（channel）上。每个flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，能和文库DNA片段两端的接头配对，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。如下图所示。
经过不断扩增，每个DNA片段都将在各自的位置上成簇（cluster），每簇都含有单个DNA模板的上千份拷贝。通过这一过程，可以将后续检测时的信号强度放大。
扩增好的模板簇需要边合成边检测。PCR反应体系中是不同荧光标记的4种dNTPs。这些dNTPs的3’-OH被化学基团所保护，每个PCR循环只能添加一个，其余的会被洗脱，接着用激光激发荧光信号，并用光学设备记录荧光信号，通过计算机转化为测序碱基。荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
相比于单细胞测序，RNAseq技术更为成熟并已形成商品化，可以检测出较多的细胞信息，在肿瘤的发生发展、疾病的进程以及细胞周期中具有很高的应用价值。
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