肿瘤活检代表了癌症诊断标准，以及用于指导精准疗法选择的主要分子检测方法。液体活检，特别是涉及血浆内游离DNA（cfDNA）的液体活检，正迅速成为标准肿瘤活检的重要微创辅助手段，在某些情况下甚至是一种潜在的替代方法。液体活检正成为分子检测、获得关于肿瘤异质性的新认识以及癌症检测和监测的有用工具。我们在本文中回顾了cfDNA分析在癌症患者中当前和潜在的临床应用。
液体活检
虽然液体活检通常指的是外周血内的cfDNA分析，但该术语还包括从血液或其他体液中分离来自肿瘤的物质（例如DNA、RNA，甚至完整细胞）并进行分析1,2（图1）。例如，完整的循环肿瘤细胞以低频率进入血流（在转移癌患者中通常每毫升血液有＜10个循环肿瘤细胞）。利用专门技术，我们可以从正常血细胞的背景中检测和分离循环肿瘤细胞，以便进行分子分析，甚至在免疫受损小鼠中植入这些细胞并让细胞生长1-3。肿瘤细胞还向血流内释放被称为外排体（exosome）的亚细胞颗粒，或者说细胞外膜包裹的囊泡，外排体含有肿瘤特异性蛋白质和核酸4。游离核酸（包括游离RNA[其稳定性低于DNA]5和cfDNA[本综述的焦点]）也被释放到循环中。
图1. 液体活检方法概述
涉及外周血的液体活检方法包括分离从肿瘤进入血流内的循环肿瘤细胞、外排体（肿瘤细胞释放的膜包裹囊泡），以及游离DNA（cfDNA，由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放）。虽然外周血是最常见的液体活检标本来源，但如图所示，其他几种体液也已被用于特定的液体活检，包括cfDNA的分离和分析。
血液不是可用于液体活检的唯一体液。尿液、粪便、脑脊液（CSF）、唾液、胸水和腹水都是潜在来源，可从中获得肿瘤来源的物质（包括cfDNA）2,6-8。虽然本综述将重点关注血液cfDNA的分析，但其他体液内cfDNA的检测和分析可能适用于特定的癌症类型（例如CSF检测适用于中枢神经系统癌症），或者适用于检测在特定器官系统中发生的癌症（例如粪便检测适用于结直肠癌，唾液检测适用于头颈部癌症）。
血浆来源的cfDNA
如Mandel和Metais在1948年首次报告的那样，术语“cfDNA”是指在血液的非细胞成分中发现的DNA片段9。目前认为，cfDNA通过凋亡或坏死释放到血液中，并且cfDNA通常为长度150～200个碱基对的双链片段，对应核小体相关DNA10。循环中的cfDNA分子被迅速清除，半衰期为1小时或更短。
来自正常细胞的cfDNA在健康人血浆中以低水平存在（平均约10～15 ng/mL）11，并且在组织应激条件下（包括运动、炎症、手术或组织损伤），cfDNA水平可能增加12。
40多年前，人们观察到癌症患者的cfDNA总体水平高于未患癌症的人11。在癌症患者中，从肿瘤细胞释放的cfDNA通常被称为循环肿瘤DNA（ctDNA），仅构成整个cfDNA的一部分。癌症患者整个cfDNA中ctDNA所占比例可能差异很大，从少于0.1%至多于90% 12,13。虽然个体患者的ctDNA所占比例往往与肿瘤负荷平行，但在患相同类型癌症的不同患者之间，已观察到显著的变异，这可能反映了个体肿瘤的生物学差异或细胞死亡率差异13。此外，患不同类型肿瘤的患者在可检出的ctDNA频率方面有显著变异。因此，在正常种系cfDNA背景中检测和分析ctDNA是一大难题。
cfDNA的分离和分析
由于来自肿瘤的cfDNA水平低、半衰期短，因此需要专门的方法来分离和分析cfDNA。两个关键问题是cfDNA本身的稳定性和正常血细胞裂解（这会导致被正常DNA污染）的可能性。为了减少这些效应，如果采用标准静脉切开采血管采集血液，然后从中分离cfDNA，通常必须在采血后1～4小时内离心并分离血浆。由于样本需要快速处理，因此在运筹管理方面造成了困难，并且处理时间差异导致的cfDNA浓度和纯度波动可能引起分析前的差异14,15。或者可以采用含有固定剂的专用cfDNA采血管，它可使cfDNA和完整细胞在室温下保持稳定长达7～14日，以便运输、储存以及分批或集中处理16。
癌症患者体内正常cfDNA背景中的ctDNA比例通常很小，并且在不同患者之间变异很大。因此，需要超灵敏的方法来检测在cfDNA中以非常低的变异体-等位基因频率（即在所有等位基因[包括野生型等位基因]中，变异体等位基因的百分比）存在的突变、拷贝数变化或其他改变（图2）。为了检测各点突变，基于聚合酶链反应（PCR）分析的突变特异性技术（例如BEAMing[小珠、乳浊液、扩增和磁性]或液滴数字PCR[ddPCR]分析）可以识别和定量cfDNA中以≤0.01%的等位基因频率存在的变化17,18。下一代测序方法也针对cfDNA进行了定制，范围包括从全基因组或全外显子组测序到有限基因组的靶向测序19-22。然而，这些方法的灵敏度和特异度受到DNA聚合酶错误率和测序反应的限制。因此，结合深度测序覆盖、分子条码方法（其中使用唯一的核苷酸条码对各输入模板DNA片段进行标记）和错误抑制算法的改良方法改进了检测限23-25。
图2. cfDNA的分离和分析
如左侧所示，通过外周血离心的方式分离血液的细胞成分（包括白细胞和红细胞）后，从血浆中分离cfDNA。在全身正常细胞释放的正常种系cfDNA的背景中，可见循环肿瘤DNA（ctDNA）（通常比例较低）。可以通过分析cfDNA鉴定在肿瘤中观察到的几种常见的基于DNA的改变，包括突变、拷贝数改变、基因融合和DNA甲基化改变。如右上角所示，由于正常cfDNA背景中的ctDNA比例常较低，因此已开发了专门的cfDNA分析方法，包括基于聚合酶链反应（PCR）分析的测序和方法（BEAMing[小珠、乳浊液、扩增和磁性]和液滴数字PCR）。通常，提供最大宽度或核苷酸覆盖率的分析方法具有较低的灵敏度，并且分析中要求ctDNA在整体cfDNA中所占比例较高（用红色显示的百分比）。相反，针对靶向突变组或单突变的方法可改进检测限。如右下角所示，用于标记各DNA分子的分子条码使cfDNA的下一代测序方法达到更好的检测限，能够区分原始模板DNA分子中存在的真实突变（因此存在于特定分子条码对应的所有测序读数中）和测序反应期间聚合酶错误引入的突变。
临床应用
无须有创肿瘤活检，而是从常规抽血中分析来自肿瘤的DNA，这一能力代表了潜在转化性临床应用的一个关键进展（图3）。特别是cfDNA分析属于微创，为活检困难或不安全的肿瘤提供了一种分子谱分析方法，并提供了一种能够随时间推移连续监测肿瘤DNA的实用方法，而没有标准肿瘤活检的风险和潜在并发症。此外，与单个肿瘤病变的针吸活检相比，cfDNA分析可以更好地检测患者肿瘤中多个不同克隆群所具有的分子异质性。最后，cfDNA分析为无临床明显疾病的患者提供了肿瘤检测或监测的可能性。
图3. cfDNA分析的临床应用
在癌症发展、诊断和治疗的整个自然过程中，cfDNA分析在多处具有潜在的应用。目前正在开发用于筛查cfDNA中新生肿瘤证据的早期检测方法。通过能够在无症状人群中识别早期癌症的液体活检，可能在治愈可能性较大的阶段识别癌症。实施根治目的的手术之后，可以分析在术后数周内采集的术后血浆中的cfDNA，确定已知存在于患者切除肿瘤中的突变或其他改变是否持续存在。由于cfDNA的半衰期非常短（1小时或更短），因此如果有证据表明术后血浆cfDNA中持续存在来自肿瘤的突变，则提供了直接证据证明患者存在可能最终导致肿瘤复发的残留疾病。如果在术后不久检出cfDNA中的残留疾病，则可以根据复发风险对患者进行分层，并可能有机会通过早期干预采取挽救性治愈。在转移性疾病的背景下，cfDNA的临床测序可以识别可能采取靶向治疗的遗传改变，以选择精准疗法。cfDNA测序与肿瘤测序相比，可以识别出许多相同的靶变化，因此当肿瘤材料不足以用于临床测序时，这可能特别有用。研究已经提示，ctDNA水平与整体肿瘤负荷密切平行，可用作监测治疗应答和耐药性发展的准确方法。疾病进展时，cfDNA分析已被证明可有效识别导致耐药的新发基因改变，这可以指导随后的治疗选择。由于在获得性耐药的背景下可能存在广泛的肿瘤异质性，因此cfDNA分析可以识别不同肿瘤转移中存在的多个并存的耐药改变，而单个肿瘤活检无法检出这样的改变。cfDNA分析已用于监测后续治疗期间多个肿瘤亚克隆的克隆动态，该方法可为对治疗产生的混合临床应答提供分子基础。
诊断和分子谱分析
用于选择治疗的肿瘤分子谱分析已成为癌症医学的基本检查26。无须有创活检，通过简单的抽血即可评估患者肿瘤分子谱，这一可能性使得cfDNA分析成为一种有吸引力的工具。然而，一个关键的初始问题是通过cfDNA检测建立的突变谱是否能够可靠地再现从直接肿瘤活检（这仍然是治疗标准）获得的突变谱。基于少数患者样本的早期研究提示，在同一患者的肿瘤和血浆样本中检出的DNA改变之间，一致性较低27, 28。然而，这些研究的效度受到以下缺点的影响：肿瘤和血浆样本通常并非同时采集，因此由于肿瘤的分子进化而产生潜在的差异。此外，许多血浆样本的采集时间欠佳，例如在治疗期间采集，而此时ctDNA处于最低水平。关键改变不一致最常见于ctDNA水平低的患者，并且低水平使得改变更难以检出。例如，最近的一项研究从40例转移性前列腺癌患者采集平行的血液样本对，使用两个商业cfDNA测序分析法对样本进行检测，并对检测性能进行比较29。研究中观察到的一致率较低，引发了对cfDNA分析重现性的质疑。然而，该研究具有重大局限性，包括以下情况，至少一半患者具有正常水平的前列腺特异性抗原，并且参与者不限于未接受治疗的患者。因此，大部分变异性可归因于cfDNA水平较低，位于或低于这些测定法的检测限。此外，如何在cfDNA水平较低的患者中获得真阳性或真阴性结果，仍然是一项重要挑战。
更大型、更仔细控制的研究已经显示，同时获得的血浆和组织样本之间，一致率高达80%～90%，特别是对于关键驱动基因发生的改变20,30-32。同样，在对大型cfDNA测序数据库进行的分析中，产生了与大规模肿瘤组织测序计划（例如癌症基因组图谱[Cancer Genome Atlas]）中突变频率密切匹配的分子景观33。
虽然这些数据提示cfDNA检测可能是肿瘤活检这一标准操作的潜在替代或辅助，但目前肿瘤活检仍然是初始病理诊断和分子检测的标准。肿瘤活检可提供组织学解释和基于非DNA改变（例如激素受体或其他蛋白质的表达）的评估，这对于诊断和治疗决策很重要。此外，大型系列研究显示转移癌患者中，约15%的ctDNA水平可能不够，无法从血浆获得突变谱，这些数值因肿瘤类型和肿瘤负荷的不同而异13,31,33。虽然改善cfDNA分析的抽血时间（例如在治疗开始之前）可以提高cfDNA检测的产出，但随着ctDNA比例接近当前技术的检测限，对关键改变是否存在的置信度降低。在解释临床cfDNA检测时必须考虑这个因素。
尽管如此，cfDNA检测仍可以在初始分子检测中发挥重要作用，特别是对于标准肿瘤活检产生的材料不足以进行临床测序的患者，而多达20%～25%的针吸活检中可能出现材料不足30,34。在这种情况下，用于治疗选择的cfDNA检测越来越多地被用作重复有创活检的替代方案，并且可能揭示对治疗有指导意义的突变，指导这些患者的治疗决策30,35。技术进步可能使得相对罕见的异常cfDNA检测变得更快、费用更低，可以识别对治疗有指导意义的突变并预测缓解的可能性（例如，存在微卫星不稳定性可预测对T细胞检查点抑制产生应答）。
对于一线或多线治疗后的重复或连续检测，微创cfDNA分析与重复有创肿瘤活检相比有许多明显的优势，重复有创肿瘤活检实用性较低、安全性较低，并且成本效益较低。特别是液体活检可以识别导致获得性耐药的新发遗传改变，进而采用新一代疗法进行靶向治疗22,36-43。最早和最好的例子之一是使用cfDNA检测来确定EGFR抑制剂治疗EGFR突变的非小细胞肺癌后，表皮生长因子受体（EGFR）T790M管家基因突变的出现。主要研究表明，cfDNA分析与组织检测在确定T790M突变的存在方面具有高度一致性，而T790M突变对第三代EGFR抑制剂（例如奥希替尼）有应答35,44。事实上，cobas EGFR突变检测可以识别血浆中的T790M和其他EGFR驱动突变，并且已被美国食品药品管理局批准作为选择特定EGFR疗法的伴随诊断45。
治疗应答情况跟踪
虽然不同患者的ctDNA水平差异可能很大，但随着时间推移，个体患者的ctDNA水平与肿瘤负荷和治疗应答的变化密切相关。与目前临床应用中的许多标准血清肿瘤标志物（例如癌胚抗原[CEA]和癌抗原125[CA 12-5]，半衰期为数日至数周）不同，cfDNA在血液循环中的半衰期较短（约1小时），这对于测定对治疗做出应答的实时肿瘤负荷非常有利38。许多标准临床肿瘤标志物的灵敏度和特异度也有限，而肿瘤特异性克隆改变（即原始肿瘤克隆中存在，因此所有肿瘤细胞都存在的改变）可以在血浆中高灵敏度地进行监测，并且是患者肿瘤特有的。一些研究提示，ctDNA水平实际上可能在治疗开始后短暂升高，因为肿瘤细胞死亡导致ctDNA释放增加6。然而，在治疗开始后的1～2周内，对治疗有应答患者的ctDNA水平急剧下降。
实际上，一些研究提示，在预测治疗应答情况方面，ctDNA的变化可能优于标准肿瘤标志物38,42。此外，ctDNA水平升高可能发生在放射学进展之前数周至数月36-38,46。因此，由于cfDNA监测技术日益普及，并且具有高成本效益，它们在检测应答或进展的早期证据方面的潜力可能对临床管理变得非常重要。
对耐药和肿瘤异质性的监测
精准癌症治疗的临床益处受限于获得性耐药的最终出现。一般而言，获得性耐药性来自一个或多个肿瘤亚克隆，这些亚克隆携带预先存在的耐药性改变，而耐药性改变是在治疗方法的选择压力下出现。对于导致临床耐药的分子改变，cfDNA分析已成为有效的早期检测和识别工具。cfDNA的一个关键优势是能够发现与耐药相关的分子异质性（图4）。获得性耐药通常以个体患者中多个耐药亚克隆的克隆生长为特征36,39,40,43,47,48。这些耐药亚克隆可能共存于同一病灶或不同的转移部位。因此，单一病变肿瘤活检可能显著低估了存在的分子异质性，而通过检测从全身肿瘤细胞脱落的cfDNA，常可发现多重耐药机制。
图4. 肿瘤异质性和cfDNA
通常认为引起获得性耐药的原因如下：某些罕见的肿瘤亚克隆携带预先存在的耐药改变。虽然所有细胞都可能携带原始克隆靶点改变，但是在一些细胞中可能有受到治疗方法的选择压力时具有适应性优势的、预先存在的亚克隆改变。随着治疗的开始，治疗可能对大多数肿瘤细胞产生细胞毒性作用，但可能会出现耐药亚群的生长，导致克隆丰度的动态变化，最终导致疾病进展。因为预先存在的耐药亚克隆可以存在于不同转移病灶内或存在于单一病灶内的不同亚群中，所以耐药的出现可以通过广泛的分子异质性来确定。因此，在疾病进展期间获得的单个肿瘤活检标本可能仅显示了耐药克隆的子集（即仅绿色），并且针对这一耐药机制的后续治疗可能导致混合的临床应答，并因其他共存克隆的生长而治疗失败。cfDNA分析有可能识别多种并存的耐药机制，并可以监测治疗期间的克隆动态。克隆改变（存在于原始肿瘤克隆中，并因此存在于所有细胞中）以灰色表示，并且耐药亚克隆改变以其他颜色表示。
实际上，结合多个肿瘤活检或尸检标本的研究已经表明，多个独特的耐药改变经常在个体患者的不同转移部位共存，但可以在单个血浆样本的cfDNA中全部检出39,40,49。在抗EGFR抗体治疗后的结直肠癌患者中进行的一项研究显示，如cfDNA中所检出的，患者可能有多达13种不同的耐药改变，只有不到10%的患者仅有一种耐药改变33。有研究在疾病进展时对匹配的肿瘤活检和cfDNA检测进行比较，结果提示在多达2/3的病例中，cfDNA检测可能会发现单个肿瘤活检未发现的其他改变50。因此，基于单个肿瘤活检的结果，靶向单一耐药机制可能导致混合的临床应答，这是由于活检标本中未采集的耐药亚克隆出现生长39，而cfDNA检测可能有助于指导治疗决策。
除了作为重要的发现工具之外，cfDNA分析在临床上还可用于管理耐药性。上文讨论了使用cfDNA在EGFR突变的肺癌中识别T790M耐药突变。其他研究表明，cfDNA分析可以识别T790M与其他耐药改变（例如MET扩增）共存的情况，而具有这种共存改变的患者在后续第三代EGFR抑制剂（例如奥希替尼）的治疗中可能获益较少44。同样，如果在雌激素受体阳性乳腺癌患者的cfDNA中检出一个或多个ESR1突变，则预示后续激素治疗的结局较差51。其他研究表明，在临床上通过标准成像或肿瘤标志物检出进展之前，可以在cfDNA中观察到对各种靶向疗法的耐药36,37,40。
cfDNA分析也被用于跟踪序贯治疗期间，甚至停止治疗后不同耐药亚克隆的克隆动态。Siravegna等发现在结直肠癌患者中，EGFR阻断期间出现的RAS突变在EGFR指导的治疗停止后，在cfDNA中可能降至不可测的水平，并且其中许多患者可能在之后重新开始EGFR治疗后获益46。将实时cfDNA分析纳入临床试验，并最终纳入标准临床管理，有可能成为精准医学的宝贵工具。
术后残留病变的检测
在cfDNA分析最具变革性的潜在应用中，有一种可能是它能够在没有临床明显疾病的患者中检测肿瘤的存在——例如，作为筛查工具用于新发癌症的早期检测，或者用于手术或辅助治疗后肿瘤复发的检测。通常，可以治愈实体瘤的主要手段是手术切除。如果术后有肿瘤细胞残留，则可导致肿瘤最终复发。在高危患者中，辅助化疗可以降低复发风险。然而，目前无法在术后立即确定哪些患者有残留病变，哪些患者的疾病已经治愈。我们在特定情况下（例如临床风险低且没有淋巴结或远处转移证据的Ⅱ期结直肠癌患者）不常规给予辅助治疗，尽管这些患者中约15%可能最终复发。检测术后残留病变的有效方法可以使已经治愈的患者免于接受有潜在毒性的辅助化疗，或者可以识别有残留病变且可能从辅助治疗中获益的患者（图5）。
图5. 使用cfDNA检测残留病变和进行术后治疗管理
在实施根治目的的手术后，目前无法确定哪些患者的疾病已治愈，哪些患者有可能最终导致复发的亚临床残留病变。因此，关于辅助化疗的决策是基于临床风险分层。在结肠癌的例子中，临床风险低的Ⅱ期疾病患者仅接受观察并且不接受辅助化疗，尽管10%～15%的患者最终复发。相反，Ⅲ期疾病患者接受辅助化疗，虽然超过一半的患者可通过单独手术治愈。目前的研究集中于利用术后cfDNA来识别有残留病变的患者，这样可针对辅助治疗做出更精准的决策。简而言之，在每例患者的切除肿瘤标本中识别肿瘤特异性突变或其他改变，并且评估术后几周采集的血浆样本，确定这些改变是否持续存在，作为残留肿瘤的直接证据。随着这种方法的进一步改进，在将来的研究中，对于本来不会在标准治疗中接受辅助治疗的患者（即Ⅱ期疾病患者），如果在cfDNA中检出残留病变的证据，则有可能被分配接受辅助治疗。同样，随着这些检测的灵敏度和可靠性的提高，甚至可以根据cfDNA检测结果将本来会接受辅助治疗的患者（即Ⅲ期疾病患者）分配至低危组；可以考虑用积极监测来代替辅助治疗，从而使得许多通过单独手术即可治愈的患者免于化疗的毒性作用。研究目前正在进行中（例如DYNAMIC试验[澳大利亚新西兰临床试验注册号为ACTRN12615000381583]）。
在一项具有里程碑意义的研究中，Diehl等发现结直肠癌术后几周的cfDNA分析可以准确预测有残留病变且最终会复发的患者12。首先，通过对切除的肿瘤进行标准测序，识别各患者的肿瘤特异性突变。接下来，使用高灵敏度方法（BEAMing，可检测低至0.01%的突变等位基因频率）确定在术后约4周采集的患者血浆中是否持续存在一种或多种上述肿瘤特异性突变。即使检出痕量水平的这些突变也将提供关于残留肿瘤细胞的直接证据。一项随访研究包括178例未接受辅助化疗的Ⅱ期结肠癌患者，研究显示术后血浆中检出残留的肿瘤特异性突变与肿瘤复发的风险相关，复发风险高达未检出ctDNA患者的18倍（P＜0.001）。此外，ctDNA对复发的预测性能显著优于临床危险因素和标准肿瘤标志物（CEA）52。
同样，一些关键研究表明，术后在cfDNA中检出肿瘤特异性突变可以预测乳腺癌、肺癌和胰腺癌的残留病变和肿瘤复发53-56。这种方法有可能成为癌症患者术后管理的关键工具，目前正在前瞻性临床试验中进行检验，这些试验将评估术后残留ctDNA检测在指导辅助化疗方面的实用性（图5）。
早期癌症检测
液体活检的优势是通过对其他方面健康、无症状的人进行简单的血液检测，就可能检出早期癌症。目前尚无成熟的技术可实现这一目标，但这种方法需要具有较高的灵敏度（以检出由癌前病变或早期癌释放的痕量cfDNA或其他物质），并且还需要具有较高的特异度（以减少接受筛查的大规模未患病人群中的假阳性结果）。
其他难题使这项工作复杂化。首先，由于许多类型的癌具有KRAS、BRAF或TP53等基因的共同突变，因此在获得阳性的液体活检结果之后，可能难以将癌定位于特定器官57。此外，良性病变可能具有与癌相同的突变，并且良性病变的cfDNA也可能脱落，进入血液循环。实际上，良性痣可能具有见于晚期癌症的相同BRAF突变58。在cfDNA中可检出的突变也可以源自骨髓中异常且通常是良性的克隆群，通过称为CHIP（不确定潜能的克隆性造血）的过程产生。CHIP的发生频率随着年龄的增长呈指数增长，70岁以上人群中的发生率超过10% 59。所以CHIP是cfDNA中可检出的多种突变的常见来源，对这种方法构成了重大挑战。因此，正在探索单纯cfDNA突变检测以外的其他方法——包括肿瘤相关病毒序列（例如在与EB病毒[EBV]感染和人乳头瘤病毒感染相关的肿瘤中）和DNA甲基化变化——用于早期检测7,60,61。
最近的两项研究表明，液体活检可用于早期检出癌症。Chan等在20,174例中国患者中通过检测血浆中的EBV DNA来筛查鼻咽癌60。在两次连续检测中证实，共有309例患者（1.5%）的血浆中检出EBV DNA，其中34例患者（原始人群的0.17%）通过内镜评估确认患鼻咽癌。相反，筛查后一年内只有1例EBV DNA阴性患者出现鼻咽癌。总体而言，该方法的灵敏度和特异度分别为97.1%和98.6%。最近，Cohen等开发了一种筛查方法，将cfDNA中的突变检测与循环蛋白标志物结合，称为CancerSEEK57。在1,005例患8种常见类型肿瘤的非转移性、临床可检出肿瘤的患者中，检测结果为阳性的患者比例中位数为70%，灵敏度范围为69%～98%。总体特异度超过99%，812例健康对照中只有7例的检测结果呈阳性。此外，使用有监督的机器学习，在83%的病例中，研究者利用检出的突变和蛋白谱将癌症定位到其原发部位。
虽然这些结果令人鼓舞，但在无症状患者组成的这一更具代表性的筛查人群中进行评估至关重要。虽然需要进一步改进液体活检筛查方法并在前瞻性临床试验中进行验证，但作为早期检测工具的cfDNA分析为癌症医学提供了潜在的变革性进展。
总结和未来方向
cfDNA分析技术迅速发展，在肿瘤学中具有许多有希望的临床应用。如果要实现cfDNA分析的有效临床整合，需要仔细了解这种方法的优点和局限性，以正确解释结果，用于指导临床决策。虽然需要进一步的前瞻性研究，但cfDNA分析具有对癌症医学产生变革影响的潜力。
Disclosure forms provided by the authors are available with the full text of this article at NEJM.org.
译者：时境迁，职业翻译
校对：侯海燕，NEJM医学前沿
Ryan B. Corcoran, M.D., Ph.D., and Bruce A. Chabner, M.D.
From the Massachusetts General Hospital Cancer Center and the Department of Medicine, Harvard Medical School, Boston. Address reprint requests to Dr. Corcoran at Massachusetts General Hospital Cancer Center, 149 13th St., 7th Fl., Boston, MA 02129, or at rbcorcoran@partners.org.
1. Haber DA, Velculescu VE. Blood-based analyses of cancer: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Cancer Discov 2014;4:650-661.
2. Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nat Rev Clin Oncol 2017;14:531-548.
3. Alix-Panabières C, Pantel K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin Chem 2013;59:110-118.
4. Ruivo CF, Adem B, Silva M, Melo SA. The biology of cancer exosomes: insights and new perspectives. Cancer Res 2017;77:6480-6488.
5. Schwarzenbach H, Nishida N, Calin GA, Pantel K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol 2014;11:145-156.
6. Husain H, Melnikova VO, Kosco K, et al. Monitoring daily dynamics of early tumor response to targeted therapy by detecting circulating tumor DNA in urine. Clin Cancer Res 2017;23:4716-4723.
7. Wang Y, Springer S, Mulvey CL, et al. Detection of somatic mutations and HPV in the saliva and plasma of patients with head and neck squamous cell carcinomas. Sci Transl Med 2015;7:293ra104-293ra104.
8. De Mattos-Arruda L, Mayor R, Ng CK, et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nat Commun 2015;6:8839-8839.
9. Mandel P, Metais P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. C R Seances Soc Biol Fil 1948;142:241-243.
10. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing. Clin Chem 2010;56:1279-1286.
11. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977;37:646-650.
12. Diehl F, Schmidt K, Choti MA, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2008;14:985-990.
13. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014;6:224ra24-224ra24.
14. El Messaoudi S, Rolet F, Mouliere F, Thierry AR. Circulating cell free DNA: preanalytical considerations. Clin Chim Acta 2013;424:222-230.
15. Swinkels DW, Wiegerinck E, Steegers EA, de Kok JB. Effects of blood-processing protocols on cell-free DNA quantification in plasma. Clin Chem 2003;49:525-526.
16. Alidousty C, Brandes D, Heydt C, et al. Comparison of blood collection tubes from three different manufacturers for the collection of cell-free DNA for liquid biopsy mutation testing. J Mol Diagn 2017;19:801-804.
17. Diehl F, Li M, He Y, Kinzler KW, Vogelstein B, Dressman D. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat Methods 2006;3:551-559.
18. Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 2011;83:8604-8610.
19. Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 2012;4:136ra68-136ra68.
20. Adalsteinsson VA, Ha G, Freeman SS, et al. Scalable whole-exome sequencing of cell-free DNA reveals high concordance with metastatic tumors. Nat Commun 2017;8:1324-1324.
21. Leary RJ, Kinde I, Diehl F, et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci Transl Med 2010;2:20ra14-20ra14.
22. Murtaza M, Dawson SJ, Tsui DW, et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature 2013;497:108-112.
23. Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, Vogelstein B. Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:9530-9535.
24. Newman AM, Bratman SV, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med 2014;20:548-554.
25. Newman AM, Lovejoy AF, Klass DM, et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol 2016;34:547-555.
26. Garraway LA, Jänne PA. Circumventing cancer drug resistance in the era of personalized medicine. Cancer Discov 2012;2:214-226.
27. Kuderer NM, Burton KA, Blau S, et al. Comparison of 2 commercially available next-generation sequencing platforms in oncology. JAMA Oncol 2017;3:996-998.
28. Chae YK, Davis AA, Carneiro BA, et al. Concordance between genomic alterations assessed by next-generation sequencing in tumor tissue or circulating cell-free DNA. Oncotarget 2016;7:65364-65373.
29. Torga G, Pienta KJ. Patient-paired sample congruence between 2 commercial liquid biopsy tests. JAMA Oncol 2017 December 14 (Epub ahead of print).
30. Zill OA, Greene C, Sebisanovic D, et al. Cell-free DNA next-generation sequencing in pancreatobiliary carcinomas. Cancer Discov 2015;5:1040-1048.
31. Schrock AB, Pavlick DC, Klempner SJ, et al. Hybrid capture-based genomic profiling of circulating tumor DNA from patients with advanced cancers of the gastrointestinal tract or anus. Clin Cancer Res 2018;24:1881-1890.
32. Lanman RB, Mortimer SA, Zill OA, et al. Analytical and clinical validation of a digital sequencing panel for quantitative, highly accurate evaluation of cell-free circulating tumor DNA. PLoS One 2015;10(10):e0140712-e0140712.
33. Strickler JH, Loree JM, Ahronian LG, et al. Genomic landscape of cell-free DNA in patients with colorectal cancer. Cancer Discov 2018;8:164-173.
34. Meric-Bernstam F, Brusco L, Shaw K, et al. Feasibility of large-scale genomic testing to facilitate enrollment onto genomically matched clinical trials. J Clin Oncol 2015;33:2753-2762.
35. Oxnard GR, Thress KS, Alden RS, et al. Association between plasma genotyping and outcomes of treatment with osimertinib (AZD9291) in advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2016;34:3375-3382.
36. Diaz LA Jr, Williams RT, Wu J, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature 2012;486:537-540.
37. Misale S, Yaeger R, Hobor S, et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 2012;486:532-536.
38. Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med 2013;368:1199-1209.
39. Russo M, Siravegna G, Blaszkowsky LS, et al. Tumor heterogeneity and lesion-specific response to targeted therapy in colorectal cancer. Cancer Discov 2016;6:147-153.
40. Goyal L, Saha SK, Liu LY, et al. Polyclonal secondary FGFR2 mutations drive acquired resistance to FGFR inhibition in patients with FGFR2 fusion-positive cholangiocarcinoma. Cancer Discov 2017;7:252-263.
41. Schiavon G, Hrebien S, Garcia-Murillas I, et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Sci Transl Med 2015;7:313ra182-313ra182.
42. Corcoran RB, André T, Atreya CE, et al. Combined BRAF, EGFR, and MEK inhibition in patients with BRAFV600E-mutant colorectal cancer. Cancer Discov 2018;8:428-443.
43. Hazar-Rethinam M, Kleyman M, Han GC, et al. Convergent therapeutic strategies to overcome the heterogeneity of acquired resistance in BRAFV600E colorectal cancer. Cancer Discov 2018;8:417-427.
44. Chabon JJ, Simmons AD, Lovejoy AF, et al. Circulating tumour DNA profiling reveals heterogeneity of EGFR inhibitor resistance mechanisms in lung cancer patients. Nat Commun 2016;7:11815-11815.
45. Malapelle U, Sirera R, Jantus-Lewintre E, et al. Profile of the Roche cobas EGFR mutation test v2 for non-small cell lung cancer. Expert Rev Mol Diagn 2017;17:209-215.
46. Siravegna G, Mussolin B, Buscarino M, et al. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. Nat Med 2015;21:795-801.
47. Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883-892.
48. Piotrowska Z, Niederst MJ, Karlovich CA, et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discov 2015;5:713-722.
49. Blakely CM, Watkins TBK, Wu W, et al. Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers. Nat Genet 2017;49:1693-1704.
50. Parikh A, Goyal L, Hazar-Rethinam M, et al. Systematic liquid biopsy identifies novel and heterogeneous mechanisms of acquired resistance in gastrointestinal (GI) cancer patients. Ann Oncol 2017;28:Suppl 3:mdx262-mdx262. abstract.
51. Chandarlapaty S, Chen D, He W, et al. Prevalence of ESR1 mutations in cell-free DNA and outcomes in metastatic breast cancer: a secondary analysis of the BOLERO-2 clinical trial. JAMA Oncol 2016;2:1310-1315.
52. Tie J, Wang Y, Tomasetti C, et al. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer. Sci Transl Med 2016;8:346ra92-346ra92.
53. Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, et al. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Sci Transl Med 2015;7:302ra133-302ra133.
54. Chaudhuri AA, Chabon JJ, Lovejoy AF, et al. Early detection of molecular residual disease in localized lung cancer by circulating tumor DNA profiling. Cancer Discov 2017;7:1394-1403.
55. Sausen M, Phallen J, Adleff V, et al. Clinical implications of genomic alterations in the tumour and circulation of pancreatic cancer patients. Nat Commun 2015;6:7686-7686.
56. Beaver JA, Jelovac D, Balukrishna S, et al. Detection of cancer DNA in plasma of patients with early-stage breast cancer. Clin Cancer Res 2014;20:2643-2650.
57. Cohen JD, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 2018;359:926-930.
58. Shain AH, Yeh I, Kovalyshyn I, et al. The genetic evolution of melanoma from precursor lesions. N Engl J Med 2015;373:1926-1936.
59. Jaiswal S, Fontanillas P, Flannick J, et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. N Engl J Med 2014;371:2488-2498.
60. Chan KCA, Woo JKS, King A, et al. Analysis of plasma Epstein–Barr virus DNA to screen for nasopharyngeal cancer. N Engl J Med 2017;377:513-522.
61. Chan KC, Jiang P, Chan CW, et al. Noninvasive detection of cancer-associated genome-wide hypomethylation and copy number aberrations by plasma DNA bisulfite sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110:18761-18768.
联系客服
