前言
乙型肝炎病毒（HBV）感染可引发慢性肝炎、肝硬化、肝细胞性肝癌（HCC）等，严重危害全球人类健康，并造成巨大的社会负担。HBV病毒基因组为松弛型的部分双链的环状DNA（rcDNA），以前基因组RNA（pgRNA）为模板逆转录形成。HBV感染宿主细胞后，rcDNA会入核并转化为共价闭合环状DNA（cccDNA）。cccDNA在宿主细胞核内长期稳定且难以被彻底清除，其能借助宿主细胞的转录体系转录表达HBV的各类转录本，被认为是HBV感染慢性化和难以清除的罪魁祸首。
尽管已有研究显示HBV cccDNA在组装形成过程中会加入宿主细胞组蛋白，但对于哪些组蛋白会富集在cccDNA上以及富集的机制仍有很多不解。除了cccDNA，整合型的HBV DNA在肝细胞病化的过程中也起着关键的作用，而对于这类HBV DNA与宿主细胞的相互作用机制也不十分明确。基于这些原因，我们采用了一种高敏感度的方法——high-throughput genome-wide translocation sequencing-coupled chromosome conformation capture（HTGTS-3C），在全基因组层面上检测了HBV DNA与宿主DNA的相互作用，揭示了HBV cccDNA和整合的HBV与宿主基因相互作用的空间图谱。同时，也进一步证实了HBV能与宿主基因组共享表观遗传相关机制。
首先，利用HTGTS-3C技术，我们在HepG2-NTCP和HepAD38细胞系发现了HBV DNA与宿主DNA的接触，这种接触会以不同密度分布于所有的染色体上，但每条染色体上的分布密度存在显著差异。其中在13、15、18、21、X、Y号染色体上，只有较少的HBV DNA与宿主DNA接触点，而16、17、19、30号染色体具有更多的接触点。这些结果说明HBV与宿主DNA的接触是非随机性的（图1）。
图1：宿主基因组中HBV-DNA与宿主DNA接触点的分布
我们接着提出问题，HBV与宿主DNA相互接触的分布与什么因素有关？我们知道，在HBV cccDNA在组装过程中，cccDNA上会加入宿主细胞的组蛋白，而细胞的组蛋白修饰与宿主细胞的基因表达有关，因此HBV cccDNA的转录活动是否也与宿主细胞的组蛋白的修饰情况相关呢？根据之前的报道，cccDNA上存在包括H3K4me2，H3K4me3，H3K9ac，H3K27ac，H3K36me3和H3K9me3在内的一系列组蛋白修饰。而无论在宿主细胞还是HBV DNA上，H3K4me2，H3K4me3，H3K9ac，H3K27ac，H3K36me3与活跃的基因表达有关，H3K9me3则与基因表达沉默相关。基于此，我们以250kb为检测尺度，检测HBV DNA在每条染色体上的富集与宿主DNA上不同的组蛋白修饰分布的相关性，并发现HBV DNA与宿主DNA的接触区域与H3K4me2，H3K4me3，H3K9ac，H3K27ac，H3K36me3修饰富集区域正相关，而与H3K9me3修饰富集区域负相关（图2）。考虑到H3K4me3修饰多位于转录起始位点（TSSs）、H3K27ac修饰多预示着激活的启动子与增强子，因此我们进一步检测了HBV DNA与宿主细胞接触区域的密度与TSSs、增强子、CpG岛等组件的密度之间的相关性。诚如预期，我们发现HBV DNA也与宿主DNA上这些转录激活位点的富集情况成正相关。综合这些实验结果，我们认为HBV DNA与宿主DNA的接触更倾向于集中在基因表达活跃的区域，同时我们的结果还为HBV DNA与宿主DNA之间共享的组蛋白调节器分布情况提供了一个三维结构框架。
图2：HBV DNA与宿主DNA的接触更倾向于集中于转录活性高的区域
在这些实验中，除了那些被报道过的HBV cccDNA上的组蛋白修饰以外，我们还发现宿主细胞基因组上的H3K4me1修饰的分布密度也同样与HBV DNA和宿主DNA的接触点的密度正相关，在HBV cccDNA的组蛋白中也存在H3K4me1的相关修饰（图2a-c）。为了进一步证明H3K4me1对HBV DNA转录与复制的作用，我们在HepAD38细胞系中敲低了H3K4me1的两个关键甲基转移酶KMT2C和KMT2D，发现HBV的RNA表达显著降低（图3a-e），同样的，HBeAg和HBsAg的表达也显著降低（图3f-g）。结合这些结果，我们认为H3K4me1修饰会富集于HBV DNA上，并对HBV的相关基因的表达进行调控。
图3：KMT2C/D调控HBV转录
由于HBV引起的HCC与HBV在宿主基因组中的整合相关，因此我们同样想了解整合型的HBV DNA与宿主DNA之间接触的特点。通过HTGTS-3C技术，我们进一步展示了在2与21号染色体上HBV与宿主DNA之间的接触位点（图4a-b），并且看到HBV DNA能在2号染色体上形成了一个染色质环（chromatin loop）的结构。通过与HepG2细胞系的表观修饰分布进行比对发现，在2号染色体的HBV DNA与宿主DNA接触密集的位点上，H3K27ac，H3K9ac和H3Kme1修饰都存在一定程度的富集，而H3K9me3修饰则较少出现；而在21号染色体上，宿主DNA的组蛋白修饰的分布基本不存在偏好性，但H3K9me3修饰在整条染色体上都有较高水平的表达。这些结果表明，整合型的HBV DNA会在细胞转录活跃区域与宿主DNA接触，在接触的过程中还能形成一个染色质环的结构。
图4：在染色体中整合的HBV DNA的基因组构造
接着，利用RNA测序（RNA-seq）技术发现，在能表达完整HBV的HepAD38细胞系中去除DOX的抑制后，有364个基因表达上调，535个基因表达下调（图5a）。在这些受影响的基因中，大部分都集中于HIF-1信号通路。我们通过比对HBV DNA与宿主DNA接触的区域和RNA-seq的结果，发现HBV对宿主基因表达的影响主要是与HBV DNA与宿主DNA的接触有关（图5b）。在对表达受HBV接触影响的宿主基因进行通路富集分析后发现，这些受影响的基因富集于甲状旁腺激素的合成、分泌和作用途径（图5c）。我们还发现，受到HBV分泌的诱导影响的上调基因也在2号染色体的HBV DNA整合位点附近有富集。以上结果表明，HBV感染引起的宿主细胞基因表达变化主要是与HBV DNA与宿主DNA之间的接触有关。
图5：HBV DNA与宿主DNA的接触对宿主基因表达的影响
结论
综上所述，我们的研究发现，在HBV感染后宿主细胞内广泛存在HBV DNA与宿主DNA相互接触的现象。这些接触并不是随机分布于宿主的所有染色体上，而是倾向于富集在宿主细胞的基因表达活跃区。同时，HBV DNA与宿主DNA的接触能在KMT2C/D的帮助下富集H3K4me1组蛋白修饰。而H3K4me1修饰会有助于激活HBV的转录活性，从而影响HBV的表达。另外，整合在宿主细胞基因组中的HBV DNA还能在转录活性区域形成染色质环状结构。最后，HBV的感染会通过HBV DNA与宿主细胞DNA接触来影响宿主细胞的基因表达。这些发现揭示了部分HBV与宿主细胞DNA相互作用的3D结构，这为我们更好地理解HBV引起的相关肝病进展的机制做出贡献。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41421-020-00218-1 Cell 174, 102–116. e114 (2018)
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