两种密码子优化Cas9的基因敲除效率比较

生物通报道： 为在斑马鱼中获得特异且高效的基因敲除,多个实验室独立人工合成了序列彼此不一的Cas9cDNA序列,并克隆入不同的体外转录载体。来自中国科学院水生生物研究所,淡水生态与生物技术国家重点实验室的研究人员选取两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列(zCas9_bz和zCas9_wc),对斑马鱼胚胎中的7个基因(外源egfp及内源chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a)分别进行敲除,通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析比较了两种Cas9的敲除效率。结果发现,zCas9_wc在各种情况下都显现出较高的敲除效率,而zCas9_bz的效率相对较低。
基因敲除是开展基因功能研究最为重要的技术手段之一。近年来，新一代人工核酸内切酶技术——CRISPR/Cas9(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedprotein)被广泛地应用于小鼠、果蝇、斑马鱼、线虫等各种模式生物的基因敲除和基因功能研究。
CRISPR是一类广泛分布于细菌基因组中的重复结构，经转录并加工成短的crRNA(CRISPRRNA)。crRNA通过碱基配对与tracrRNA(Trans-activatingRNA)结合，形成双链RNA，引导内切酶Cas蛋白在crRNA序列靶标的特定位点剪切双链DNA。据此，科研人员typeCRISPR/Cas系统中的crRNA和tracrRNA连接起来成为一条引导RNA(GuideRNA,gRNA)，即可利用其对真核生物基因组进行改造，从而在靶标DNA上实现特定位点的剪切，靶标DNA利用非同源末端连接(Non-homologousend joining, NHEJ)机制进行双链DNA修复的过程中有可能引入插入或缺失(Indel)突变。

 斑马鱼具有饲育容易、体外受精、体外发育、胚胎透明、组织器官再生能力强等诸多优点，从而成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的重要模式动物。由于斑马鱼产卵量较大且易于显微注射，以CIRSPR/Cas9基因组编辑技术为基础，研究者先后在斑马鱼中实现了基因组水平的定点敲入、多基因平行敲除、同源序列介导的精确整合等。在利用CRISPR/Cas9技术制备斑马鱼突变品系的过程中，往往需要保证较高的P0代突变效率，从而减少后续突变体筛选所需投入的人力和物力。目前，在斑马鱼研究领域较为广泛使用的Cas9基因序列包括根据哺乳动物密码子优化的人源化hCas9，以及根据斑马鱼密码子优化的zCas9等。密码子分部情况计算

在这篇文章中，研究人员选取了zCas9_bz和zCas9_wc两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码载体体外合成mRNA，针对斑马鱼外源egfp基因以及chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr和tcf7l1a等6个内源基因进行敲除，并逐一比较了这两种Cas9对这7个基因在特定靶位的敲除效率，以期为研究者日后选用Cas9在斑马鱼中进行基因敲除提供参考。
这项研究采取了靶点PCR产物直接测序法。该方法非常简单易行，仅需要开展一次PCR反应和一个测序反应。一般而言，从显微注射到效率评估可以在3日内完成。对突变靶点的序列详细分析表明，这两种Cas9蛋白导致的靶位突变并不存在序列上的偏好性，因此这两种Cas9敲除效率的差异应该不是由于Cas9识别靶位的特异性所导致，而可能是由于密码子优化、Kozak序列、核定位信号、N端标签等诸多因素的存在与否所综合导致。
研究人员还发现一个有趣的现象：针对早期发育必需基因chd进行Cas9敲除时，获得了典型的腹部化表型，测序结果分析表明所有出现腹部化表型的胚胎均可获得100%的敲除效率，而表型为野生型的胚胎的敲除效率则为0%。后续养殖实验显示，出现腹部化表型的胚胎很难被继续饲养至性成熟，而仅有那些没有出现表型的胚胎可以被养至性成熟。这就出现了一个敲除效率和养殖存活率之间的悖论：亦即从获得基因敲除子代的角度而言，必需选取那些具有显著表型的胚胎继续饲养；而从养殖存活率的角度而言，又限制了我们选取这部分胚胎。因此，在日后的研究中，当涉及到早期发育必需基因的高效敲除时，可能需要利用原始生殖细胞替换等技术手段来解决这一问题。
这一研究针对斑马鱼外源egfp基因及chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a等6个内源基因的共计7个靶位，通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析，系统比较了zCas9_bz及zCas9_wc对其敲除的效率。结果显示zCas9_wc效率较高，且对相当多的靶位的敲除效率接近100%。这为研究者日后在斑马鱼中开展CIRSPR/Cas9介导的基因敲除时选择Cas9编码序列提供了有益的参考。
原文检索：
张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言,孙永华. 两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J]. 遗传,2016, 38(2): 144-154.
Fenghua Zhang, Houpeng Wang, Siyu Huang, Feng Xiong, Zuoyan Zhu,Yonghua Sun. A comparison of the knockout efficiencies of twocodon-optimized Cas9 coding sequences in zebrafish embryos.HEREDITAS(Beijing), 2016, 38(2): 144-154.