小鼠脾脏细胞悬液制备流程

1. 脱颈处死小鼠，腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。

2. 75％乙醇消毒，剪开腹部切取脾脏。

3. 将脾脏放入预先放置好cell strainer（FALCON，352350）并已加入5ml 无菌PBS的六孔板或培养皿中。

4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。

5. 弃掉cell strainer，轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到一无菌15 ml离心管中，于4℃ 400g，离心5 min。

注：一旦取出脾脏，请置于冰上操作。

6. 将第5步离心后弃上清的脾脏细胞用5 ml无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解5 min。

注：ACK裂解液配方如下表，配好之后用0.22 μm的滤膜过滤，4℃保存不超过1月

配制 500 ml 1´ACK buffer
NH₄Cl	4.1 g
KHCO3	0.5 g
0.5 M EDTA-2Na	100 ml

7. 裂解结束后加入10 ml无菌PBS终止裂解反应，于4℃ 400g离心5 min。

8. 弃上清，用10 ml无菌PBS洗一次，弃上清后直接加入培养基重悬计数，一只脾脏可得3-10´10⁷个细胞。

注：如果要进行下一步的分离CD4+T细胞操作，请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的PBS中。