单细胞染色质可及性分析揭示了结直肠癌分子亚型的表观遗传学基础和特征转录因子
研究材料与方法
样本材料：28例病理诊断为结直肠癌的患者和1例仅为直肠腺瘤的患者
分析内容：单细胞转录组测序，表观遗传分析，基因调控网络分析，拷贝数分析，基因富集分析，聚类分群，差异基因分析等
研究结果1.结肠癌恶性上皮细胞的表观遗传调控景观研究人员基于筛选出的高质量细胞用于后续分析。通过对基因活性评分的分析，成功地鉴定了上皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞等不同类型的细胞。此外，还进一步验证了基于基因活性评分的细胞类型注释方法的有效性，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，分别从CD45+ CD3-CD19+的B细胞、CD45+ CD3+的T细胞、CD90+ CD45-的成纤维细胞以及EpCAM+ CD45-的上皮细胞中获取了单细胞转录组数据，并与手动注释的结果进行了比对，结果表明两种方法具有高度的一致性和相似性。综上所述，该章节详细介绍了作者们采用scATAC-seq技术对结肠癌恶性上皮细胞的表观遗传调控景观进行系统性研究的过程和结果，为深入探究结肠癌的发生机制提供了重要的基础数据。
图1-1 Single-cell ATAC-seq atlas of epithelial cells in colorectal cancer2.结直肠癌的恶性转化造成异质性增加通过对单细胞转录组数据的分析，研究者们发现，在结肠癌的发生和发展中，健康上皮细胞、腺瘤细胞和恶性细胞之间存在着显著的差异（fig1-1C）。其中，恶性细胞与正常细胞相比具有更高的染色体水平的拷贝数变异，这表明染色体级别的拷贝数改变可能在腺瘤阶段就已经开始发生。此外，恶性细胞还表现出更开放的染色质结构，尤其是在已知CRC标记基因的启动子附近(fig1-2D,E,F,G)。这些结果表明，CRC患者的恶性细胞具有高度个性化的表观遗传特征，且在恶性转化的过程中，异质性逐渐加剧。
图1-2 Single-cell ATAC-seq atlas of epithelial cells in colorectal cancer3.早期染色质可及性的变化通过比较腺瘤细胞和健康上皮细胞之间的染色质可及性差异，研究人员发现了20,044个在腺瘤细胞中获得的可及峰和4,028个在腺瘤细胞中失去的基因组峰（fig2-1A）。这些结果表明，失去的峰值可能与基因沉默事件密切相关，而增加的峰值则主要富集于非编码区域和远距离增强子。此外，研究人员还发现，失去的峰值与CpG岛（CGI）高度重叠，这暗示着失去的峰值可能与基因沉默事件密切相关（fig2-1B,C）。为了确定腺瘤中的早期染色质可及性变化是否在结肠癌中得到保留，研究人员比较了不同恶性转化阶段的染色质可及性差异，并发现大多数腺瘤中的染色质可及性变化在结肠癌中得到了保持。然而，腺瘤来源的染色质可及性变化只占所有结肠癌相关染色质程序的一小部分（fig2-1D,E）。研究人员推测，LEF1和TCF3等转录因子异常增殖和HOX家族转录因子异常失活可能在腺瘤形成过程中发挥重要作用。此外，研究人员还发现了一些在腺瘤中表达上调或下调的基因，在结肠癌中也得到了相似的表达模式。这些研究结果有助于更好地了解腺瘤和结肠癌的发生机制，从而为预防和治疗这两种疾病提供新的思路。
图2-1Early chromatin regulation in adenoma is tightly associated with DNA methylation4.腺瘤中染色质可及性变化与DNA甲基化变化的紧密关联研究发现，闭合染色质区域在腺瘤中表现出明显的CGI富集，并且富含甲基化相关的KLF家族转录因子，暗示着DNA甲基化可能在腺瘤早期起关键作用。研究表明，染色质可及性和DNA甲基化之间存在清晰的负相关模式。失去峰的高甲基化状态在恶性样本中得到了很大程度的维持，反映了染色质可及性趋势的变化。然而，在一小部分恶性样本中，获得峰的部分去甲基化被逆转（fig2-2F）。对于获得的峰，一些已知参与CRC进展并显示显著去甲基化的基因在启动子或基因体上（fig2-2H）。这些基因（AXIN2,KRT80,NKD2）在所有患者中都表现出在从腺瘤到CRC的转变过程中增加的染色质可及性（fig2-2I）。同时观察到DNA甲基化增加HOXA2和HOX45在腺瘤早期出现（fig2-2J），并与不同患者中一致降低的染色质可及性相结合（fig2-2K）。这些结果表明，DNA甲基化增益或损失已经发生在良性腺瘤的形成过程中，相应的染色质可及性的丧失或获得有助于调控CRC相关基因的表达。
图2-2Early chromatin regulation in adenoma is tightly associated with DNA methylation5.鉴定符合iCMS分类的表观遗传亚型研究人员通过非负矩阵分解（NMF）分析结直肠癌（CRC）患者恶性细胞的染色质可及性水平，发现了两个不同的亚型，即Group-1和Group-2。这两个亚型在低维嵌入空间中明显区分，且与临床特征密切相关（fig3A,B,C）。Group-1细胞表现出高水平的拷贝数变异（CNV），而Group-2细胞则大多为二倍体或表现出较少的CNV（fig3D）。此外，Group-1癌症均为微卫星稳定（MSS），主要起源于左侧结肠，而Group-2癌症则全部为微卫星不稳定（MSI），主要起源于右侧结肠（fig3E）。这些结果强调了我们的表观遗传分类与iCMS分类之间的强一致性。iCMS2和iCMS3得分分布反映了Group-1和Group-2细胞之间的差异，其中Group-1细胞显示更高的iCMS2得分，而Group-2细胞显示更高的iCMS3得分（fig3F,G）。表达关键模块基因MYC、CTSA、EIF6和iCMS2以及CNKN2A、ATL3、CLU和iCMS3也显示出一致模式。iCMS2和iCMS3的模块得分呈负相关，并形成了两个明显的恶性组，这与我们对Group-1和Group-2细胞的表观遗传分类相吻合（fig3H）。因此，研究人员将Group-1称为iCMS2，而Group-2称为iCMS3。这一研究为我们深入理解CRC的分子机制提供了新的视角。
图3 Unsupervised analysis identified 2 malignant groups concordant with the iCMS classification 6.结肠癌的表观遗传亚型分类通过比较健康结肠上皮细胞和结肠癌细胞的转录组表达情况，研究人员发现两种不同的表观遗传亚型，即iCMS2和iCMS3，且这两种亚型在染色质可及性方面存在显著差异，其中iCMS2亚型表现为全球性的染色质可及性增加，而iCMS3亚型则表现为特定区域的染色质可及性降低。此外，研究人员还发现了与不同亚型相关的特异性增强子和基因富集通路，这些结果揭示了结肠癌表观遗传亚型的分子机制和生物学特征。这一研究对于深入理解结肠癌的发生和发展机制具有重要意义。
图4-1Chromatin and TF regulators of iCMS subtypes7.特异性转录因子分析作者通过富集分析，发现除了iCMS2特定区域外，其他区域内最显著富集的是AP-1复合物的motif。进一步比较了所有有意义的motif以及这些motif在不同子型中的富集程度，并通过聚类分析确定了不同子型中TFs的不同富集水平（fig4-2E,F）。此外，作者还验证了这些TFs在每个组中的聚合伪块上的TF足迹活动，并比较了与这些TFs相关的motif的单细胞全基因组可及性。结果表明，FOXA3和MAFK在iCMS3肿瘤中的活性更高，而HNF4A则在iCMS2肿瘤中表现出更高的活性。这些结果强调了TF结合活性在基因表达调节中的重要作用，而不仅仅是相应TF的绝对表达水平。
图4-2 Chromatin and TF regulators of iCMS subtypes8.癌症异质性在子型水平上的机制研究研究人员发现，在同一分型内，肿瘤仍具有显著的患者特异性特征。为了探索这些异质性是如何在染色质可及性水平上形成的，研究人员进行了富集分析。结果显示，不同分型内的TF活性存在显著差异，但保持了较高的一致性。例如，PPARA、HNF4A和CDX2在iCMS2子型中高度富集，而在iCMS3子型中则相反（fig4-2G）。研究人员通过注释包含特定motif的潜在靶峰来测试TF是否也调节共享基因靶标。结果表明，虽然HNF4A在所有iCMS2子型中均高度富集，但大多数更易接近的HNF4A靶标都是集群特异性（个体患者特异性），仅有不到10％的靶标（1,945个）在超过80％的簇中共享（共享）。对于iCMS3肿瘤，类似的模式也在SOX2、PPARA和FOXA3中观察到（fig4-2H）。这一现象与之前对结肠癌样品的单细胞RNA测序数据的研究结果相似，这表明即使在同一分型内，RNA表达的强异质性也可以被相应的强异质性TF激活所解释。只有大约十分之一的同一TF的靶标在同一种子型的大多数患者中广泛激活，这成为同一种子型的不同结肠癌患者的共同核心表观遗传标志（fig4-2I）。 9.肿瘤内异质性的表观遗传调控在7位患者体内发现多个CNV定义亚克隆，其中5位患者被归类为iCMS2亚型，这与iCMS2肿瘤表现出更高的CNV频率相一致。这些亚克隆可以通过至少一个臂级CNV特征相互区分。每个患者的亚克隆数量从2到5不等，最小的亚克隆由24个具有相同CNV表型的单细胞组成。在这7位患者中，P26展示了最高的肿瘤内异质性水平。P26的恶性细胞包括5个CNV定义的亚克隆（subclone_1-5），分布在两个上皮簇（C10，C16）之间，具有不同的染色质可及性谱系（fig5B,C）。为了进一步了解肿瘤进化的表观遗传机制，研究人员鉴定了P26每个亚克隆中的差异可及峰。C10簇的亚克隆在很大程度上共享着染色质程序，同样，C16簇的亚克隆也是如此。与系统发育关系一致的是，C16簇的亚克隆在更多区域显示出了改变的染色质可及性（fig5F）。在C10簇亚克隆中iCMS2特异性TFs的进一步增强活动得到了验证，通过全基因组TF活性评分进行了证实（fig5H）。这种iCMS特异性TFs的逐渐激活与iCMS模块基因的表达模式相符，为我们提供了深入了解iCMS现象形成期间的表观遗传机制的见解。
图 5 Epigenetic regulation of tumor evolution10.结肠癌中的CIMP亚型分析研究人员采用了一种无监督的方法来分析染色质可及性的分布情况，并发现其与已知的iCMS分类高度一致。在此基础上，利用之前已经确定好的CIMP(CpG岛甲基化表型)标记物来识别CIMP亚型。他们在每个恶性肿瘤群集中量化了与8个已知CIMP标记物相关的CGI区域的染色质可及性，并通过聚类分析发现了三个不同的CIMP亚型：高甲基化的CIMP-High亚型、低甲基化的CIMP-Low亚型以及中等甲基化的CIMP-Intermediate亚型（fig5A）。此外，他们还比较了不同CIMP亚型的TF活性空间和peak accessibility空间，发现在这些维度上它们并没有明显的区别（fig6-1B）。最后，他们还探讨了CIMP分类与iCMS分类之间的关系，发现CIMP-High细胞在iCMS分类中分布较为均匀，而CIMP-Negative细胞则主要分布在iCMS2类别中（fig6-1D）。总之，这一研究提供了一种新的方法来识别结肠癌中的CIMP亚型，并强调了采用监督学习方法的重要性。
图6-1 Identification and epigenetic characterization of CIMP subtypes11.CIMP子型的差异性研究首先，作者们通过对健康结肠上皮细胞与三种CIMP子型（CIMP-Low、CIMP-Medium和CIMP-High）之间的可及性差异进行比较，发现所有三个子型都显示出了大量的获得峰，而失去峰的数量相对较少。然而，值得注意的是，CIMP-High组表现出相对于其他两个子型更低的获得峰数量。这一结果表明了CIMP-High子型的大规模DNA高甲基化的特征。其次，作者们进一步分析了每个CIMP子型中获得峰的富集情况，并发现在所有的CIMP子型中，AP-1复合物的motif都有显著的富集。此外，CIMP-Negative肿瘤还高度富集了HNF4Amotif，这是之前被识别为iCMS2结直肠癌的标记motif。这一结果符合CIMP-Negative肿瘤仅由iCMS2细胞组成的事实。接下来，作者们关注于与CIMP-High子型特异性相关的TF，因为这个子型已经被充分研究并与其显著降低癌症特定死亡率有关。结果显示，在CIMP-High组中，TCFmotifs、TEADmotifs和LEFMotif具有更高的富集度。这些TF在CIMP-High肿瘤中的高富集程度得到了单细胞基因活动分数、TFmotif活性以及聚合伪大块中的TF足迹分析的进一步证实（fig6-2G,H）。这种CpG丰富的KLF家族motif已被发现在各种癌症类型的DNA甲基化可及性区域中富集。一些KLF家族TF已被鉴定为5mC读者，并与甲基化的CpG位点结合。这暗示着KLF家族TFs活性的丧失可能会导致它们靶向区域的染色质不可及性和DNA甲基化的增加，从而沉默这些目标基因在CIMP-High结肠癌中的表达。 最后，作者们注意到LEF1和TCF家族motif，这两种在CIMP-High组中表现出更高活性的motif，之前已经在iCMS2和iCMS3结肠癌的共同获得峰中高度富集。这一观察结果与CIMP-High肿瘤几乎均匀分布在iCMS2和iCMS3这两类中的现象相一致。这一现象表明，TFs可以在基因表达和细胞表型方面发挥关键的调节作用，并可以作为连接基于转录组和DNA甲基化分类的结肠癌的常见机制和桥梁。
图6-2 Identification and epigenetic characterization of CIMP subtypes
12.网络分析确定了与多层CRC分类相关的TF模块在研究中，发现了多个转录因子与iCMS分类或CIMP分类有关联。鉴定了13个不同的转录因子模块，每个模块内部的转录因子活动具有高内聚性（fig7-1A）。iCMS分类与模块5和模块8的活动显著相关（fig7-1B,C）。CIMP分类与模块8和模块11显著相关。值得注意的是，模块8在iCMS和CIMP亚型中均表现出显著差异（fig7-1B,C）。这可能是因为这些两个分类背后共享的调控机制，或者是CIMP阴性肿瘤中的iCMS2亚型偏倚。不同的转录因子共激活模块调节不同的下游靶点，从而影响结直肠癌的不同方面。模块5和模块8的特征向量得分在独立发表的数据集中与iCMS分类高度相关，而其他模块则没有显著相关性。这证实了转录因子模块能够有效地区分不同的患者亚型。
图7-1Network analysis identified co-activated TF modules related to multi-layer CRC heterogeneities.13.CRC不同表型相关的主控转录因子通过对每个TF模块内部结构的深入研究，发现在MSI患者中，模块9显著相关，且其中的成员TFs之前已经被报道与MSI状态有关。CDX2、TCF7L2和HOXA TFs与MSI状态显著相关。iCMS分类显示与模块8最显著相关，主要由SOX和核受体家族TFs组成。值得注意的是，HNF4A和PPARA这两个在我们之前的分析中表现出高iCMS2特异性活性的TF，在模块8中成为顶级热点。同时，其他核受体家族TFs如NR2F6、RARB和NRlH2等也显示出与iCMS分类和模块成员资格相似的关联程度。这些发现强调了这些TFs在iCMS2肿瘤中的关键作用。 14.iCMS特定表达程序相关的TF模块研究人员检查了TF模块与iCMS特定基因表达程序之间的相关性。结果显示，几个TF模块与iCMS标志物显著相关联。值得注意的是，不同的TF模块与完全不同的标志基因集有关。模块5、6和8均与iCMS2标志物相关（fig7-2F、G）。这表明模块5和6的TF主要抑制在iCMS2患者中特异性下调的基因，而模块8的TF主要激活在iCMS2患者中特异性上调的基因。与此相一致的是，在iCMS2亚型中多个上调的标志基因，包括LAMP2、ASXL1、FNI、TOP1MT和CDK5RAP1，是模块8 TF HNF4A在肠道上皮细胞中的直接靶基因。同样，模块8和模块9仅与iCMS3下调的标志基因相关，而模块5和6强烈相关于iCMS3上调的标志基因（fig7-2F）。这些结果揭示了TF模块与iCMS特定表达程序的相关性，为进一步研究TF调节子型表型提供了基础。
图7-2Network analysis identified co-activated TF modules related to multi-layer CRC heterogeneities. 文章小结本研究的重点在于研究结肠癌的表观遗传学特征，包括DNA甲基化和染色质状态的变化。通过对29位患者的单细胞染色质可及性图谱进行分析，发现了两种不同的表观遗传学亚型，这些亚型与已知的iCMS分类完全匹配。此外，研究人员还确定了关键的转录因子，如HNF4A、PPARA、FOXA3和MAFK，它们在不同亚型中发挥着重要作用，从而更好地解释结肠癌的异质性和分子亚型之间的关系。文献索引 Single-cell chromatin accessibility analysis reveals the epigenetic basis and signature transcription factors for the molecular subtypes of colorectal cancers SCI科研热点、生信技术、好文分享可关注
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