结肠癌靶向治疗的研究进展

1 分子靶向药物

分子靶向药物分为两大类：小分子信号传导抑制剂和大分子单克隆抗体。前者能够特异性地阻断肿瘤生长、增殖过程中所必需的信号传导通路而消除癌细胞，可口服用药，具有特异性强、半衰期短等特点。后者通过抗原抗体的特异性结合来识别肿瘤细胞，大多需静脉给药，具有高度特异性、不通过肝脏代谢、半衰期长等特点。下文介绍近年来这两类药物的研究热点。

1.1 小分子信号传导抑制剂

1.1.1 Wnt通路相关抑制剂

约90%的结肠癌与Wnt信号通路的异常激活有关，因此Wnt信号通路调控机制的研究成为近年来寻找结肠癌靶向药物的研究热点。 Wnt信号通路的主要成分包括：分泌蛋白Wnt家族、卷曲蛋白(frizzled proteins, Fz)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1,CK1)、蓬乱蛋白(dishevelled, Dsh或Dvl)、腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)、 β-连环蛋白(β-catenin)、轴蛋白(Axin)以及T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)家族。这些主要调节因子的基因突变，都会造成与肿瘤相关的生长基因的过量表达，以及促进癌细胞的转移。 Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，目前认为它包括三个分支：经典Wnt信号通路，通过β-catenin的沉积，使细胞核内β-Catenin与TCF/LEF结合开启下游靶基因的转录，从而导致细胞增殖异常和肿瘤发生； Wnt/PCP通路，通过小G蛋白激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)来调控细胞骨架重排，肿瘤细胞的变形、迁移、极化等； Wnt/Ca2 通路，通过释放胞内Ca2 来影响细胞黏连和相关基因表达。

APC蛋白在Wnt信号通路中具有重要作用。研究人员发现，截短、突变的APC一般只保留其N端部分，而该处包含ARM(Armadillo)结构域，可以与APC激活鸟嘌呤核苷酸交换因子(APC-stimulatedguanine nucleotide exchange factor, Asef)的APC结合区域相连接，激活处于抑制状态的Asef。随后，Asef使鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)激活下游的小分子GTP酶Cdc42，导致由GTP生成的GDP减少，细胞黏附能力下降，肿瘤细胞脱落，促进细胞迁移。此外，APC也可通过JNK途径使基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase 9, MMP9)的表达上调，从而促进癌细胞迁移和血管生成[7-9]。近年研究发现， 80%以上的结肠癌恶性转移患者的体内都出现异常APC结合Asef蛋白，其通过持续激活GEFs而推动结肠癌的转移过程。 Jiang等[10]研究发现， MAIT-203可选择性阻断APC-Asef蛋白间相互作用而不影响APC与其他蛋白的亲和力。作为首类用于抗癌的蛋白质间相互作用抑制剂， MAIT-203的最高抑制活性Ki值高达0.015 µM，并能干扰Asef介导的Cdc42活化，从而在阻碍结肠癌的转移方面展现出巨大的潜力。

β-catenin是Wnt信号转导通路的正性调节因素，可以引起细胞的增殖，导致肿瘤的发生。近年来在对结肠癌的分子靶向治疗研究中相继发现几种Wnt/β-catenin信号传导抑制剂，可作用于结肠癌相关基因，如在结肠癌细胞中卡西霉素可以抑制参与激活β-catenin活性的靶向基因，如S100A4、CyclinD1、 c-myc和DKK-1，降低β-catenin活性。喹唑啉可以抑制结肠癌患者的β-catenin(CTNNB1)或APC基因突变，从而抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导，但不改变结肠直肠癌细胞中β-catenin的水平，从而表明喹唑啉是作用于Wnt途径的下游元件。其次，还可作用于β-Catenin相关复合物，如ICG-001作为C末端结合蛋白(C-terminal binding protein,CBP)抑制剂可以阻断β-catenin与CBP结合，消除Wnt信号通路的传导，抑制结肠癌肿瘤细胞增殖，具有抑制细胞生长的叠加效应。苯并咪唑类似物SRI36160由LRP6与Wnt3A介导而抑制Wnt通路可作为Wnt /β-catenin信号传导的有效抑制剂，并且不影响STAT3或mTORC1信号对结肠直肠癌细胞凋亡调节作用，从而在结肠癌中选择性抑制Wnt通路并有效地抑制增殖。 Urushibara等还发现抑制剂IC-2可降低WNT/β-catenin转录活性， IC-2和5-氟尿嘧啶(Fluorouracil, 5-FU)可联合作用于结肠癌的治疗。

研究发现，异常的Wnt信号通路在维持结肠癌干细胞(CSCs)的稳定性中起着重要的作用。Wnt/β-catenin信号传导与CSCs的自我更新有关，可形成不同的后代，并导致抗药性，促进结肠癌的转移和复发。 TRAF2和NCK相互作用蛋白激酶(TRAF2 and NCK-interacting protein kinase, TNIK)是TCF4和β-catenin转录复合物的关键调节成分，影响结直肠癌干细胞的肿瘤启动功能。 TNIK在Wnt信号途径的最下游发挥调控作用， Masuda等研究发现第一个可以口服的抗Wnt活性小分子TNIK抑制剂NCB-0846，这种化合物能够有效抑制TNIK激酶活性，在小鼠模型中能阻断Wnt信号传
导和Wnt信号驱动的结肠直肠癌。Axin是一种支架蛋白，能与APC、 CK1等形
成β-catenin降解复合物。研究显示XAV-939是Wnt信号通路的一种新型小分子抑制剂，可以通过与多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly- ADP-ribose polymerase, PARP)的结构域结合来促使Axin稳定，诱导β-catenin降解从而抑制经典Wnt信号通路的激活。在5-FU或顺铂的联合作用下， XAV-939还可以通过降低结肠癌细胞中β-catenin、 Axin和CSCs标记物的表达水平而诱导细胞凋亡[20]，同时，该文还指出XAV-939作用于β-catenin后将增强结肠癌细胞的化疗药抗性，虽具体机制仍待深入研究，但为肿瘤细胞耐药性机制及其潜在的治疗靶点提供了新方向。

1.1.2 PI3K-AKT-mTOR通路相关抑制剂

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3Ks)属于脂质激酶家族成员，参与细胞糖酵解与脂肪生成等代谢过程并能调节肿瘤的血管生成。 PI3K/Akt/mTOR信号传导通路诱导肿瘤发生可以通过以下多种机制参与细胞自噬，如PI3K特异性抑制剂三甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)能抑制自噬的发生；通过多种机制抑制细胞凋亡，如抑制Bax的构象变化，在线粒体膜电位水平上磷酸化其他凋亡结构的组分如Bad和caspases9；通过在细胞核中下调肿瘤抑制蛋白p53表达等[21]。 Hussain等研究发现，新型PI3K抑制剂DHNQ(3-Dihydro-2-(naphthalene-1-yl) quinazolin-4(1H)-one)能够抑制PI3Kα而降低结肠癌细胞中糖与脂肪代谢的关键性调节酶，磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶M2以及脂肪酸合成酶的表达，同时观察到经过DHNQ治疗后，固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein-1, SREBP1)在核内的水平将降低，并且限制脂肪酸合成酶相关基因的转录，提示DHNQ能作用于转录因子而改变结肠癌细胞中代谢相关基因的表达。 DHNQ也能靶向
抑制血管内皮生长因子受体2(vascular endothelialgrowth factor receptor 2, VEGFR2)而阻碍血管内皮生长因子介导的血管生成，从而抑制结肠癌细胞的增殖与转移过程。此外，有研究显示PI3K激酶抑制剂LY294002可增加5-FU活性，抑制肿瘤的生长和转移。其次， PI3K-AKT-mTOR信号通路在结肠癌干细胞中被高度活化，研究发现PI3K激酶抑制剂BEZ235可通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路，进而抑制结肠癌干细胞增殖。近年来结肠癌与AKT相关抑制剂的研究较少，在此不做进一步阐述。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin, mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面起到重要作用。近年来发现mTOR相关的信号通路复杂且涉及面广泛，其中多个元素的调控异常都与肿瘤的发生密切相关。 mTOR抑制剂能够抑制由于该信号通路异常引起的癌基因的活化、肿瘤的生长和肿瘤血管生成。 Faller等发现， mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)能够抑制APC基因缺失的肿瘤细胞内蛋白翻译的翻译延长过程，引起肿瘤细胞生长停滞，因此提出临床用雷帕霉素能靶向抑制mTOR通路及控制蛋白质翻译的药物或许能
为高危结肠癌患者的化学预防提供可行的策略。随后， Karki等[26]研究发现，作为机体固有免疫系统中的一员， Nod样受体(Nod-like receptors, NLRs)家族成员NLRC3(又称NOD3)在抑制结肠细胞发生癌变中发挥着至关重要的作用。在动物实验中，研究人员已确定NLRC3主要作用于结肠上皮细胞，保护肠道免受因感染而导致的炎症和结肠瘤发展，并且NLRC3能抑制mTOR信号通路的激活并抑制细胞增殖和干细胞来源的组织形成。此外， NLRC3还与PI3K相关，能在结合生长因子受体或Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)后阻碍PI3K依赖性激酶AKT的活化。在利用人结肠细胞开展的研究中， NLRC3基因过度表达时，细胞增殖水平将极大地降低。这提示着，如果我们在临床上以某种方法诱导NLRC3表达，那么它或许能通过阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路在抗结肠癌血管生成等方面起到治疗作用。目前关于NLRC3的作用方式，如其功能的发挥是否依赖于特异性受体等，仍有待探索。但可以期待的是NLRC3作为体内固有免疫系统的成员，其功能的深入研究将以不同于外源性药物的方式为结肠癌的治疗开拓新的道路。

1.1.3 TGF-β信号通路抑制剂

转化生长因子β(transforming growth factors-β,TGF-β)是一类具有多种生物学活性的细胞因子，其在结肠中表达时，既可作为肿瘤抑制因子，又可作为肿瘤启动子在结肠癌发生过程中起到双重作用。 TGF-β在肿瘤早期可抑制细胞增殖、启动细胞分化并诱导凋亡，但在肿瘤的进展期则可通过多种机制促进肿瘤的侵袭和转移。 TGF-β通路促进肿瘤转移的机制主要有3个方面：(1)TGF-β可从抑癌因子转化为促进癌转移因子，且由Smad介导在肿瘤转移中发挥作用；(2)TGF-β通过增加癌细胞与胞外基质的相互作用、 抑制免疫系统和增加血管生成等促进肿瘤的侵袭和转移；(3)上皮间充质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是肿瘤浸润、 转移的重要机制，而TGF-β在诱发EMT中起关键作用，被认为是诱导组织纤维化的“控制开关。 Akbari等发现TGF-β受体Ｉ激酶抑制剂SD-208能诱导结肠腺癌中miR-135b的下调，SD-208通过TGF-β信号通路作为不同恶性肿瘤的抗癌剂。这项工作旨在显示TGF-β信号转导对结肠癌 m i R N A 的 影 响 ， 并 发 现 S D - 2 0 8 可 以 调 节miR135b潜在的下游肿瘤抑制基因靶向表达，其抗癌作用可能是由于其调节miRNA表达的能力。

1.1.4 EGFR通路抑制剂

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在结肠直肠癌中广泛表达，促进癌细胞生长和增殖。 EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受体亚家族的一个成员，该家族的其他成员包括HER2/neu、 HER3和HER4。它们的受体均由三部分组成：胞外的配体结合区、由单链构成的跨膜区以及胞内的酪氨酸激酶区。 EGFR是许多正常上皮组织(如皮肤和毛囊)的组成性表达成分，在很多人类肿瘤中发现有EGFR的过量表达。活化的EGFR主要与以下信号传导通路有关：丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径，启动DNA复制，引起细胞增殖与分化； PI3K-Akt途径，抑制细胞凋亡；活化下游血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，促进微血管网生成；上皮生长因子受体信号转导与转录激活因子3(EGFR-STAT3)途径，使STAT3在许多肿瘤中活化，调节多种基因的活性，从而参与肿瘤的发生、发展和细胞凋亡。

EGFR信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。因此，抑制EGFR的活性可能是癌症治疗的临床策略。以往常用的EGFR抑制剂以吉非替尼为例，可以与多种化疗药物产生协同作用。 Yu等以人结肠腺癌HT29和SW480细胞作为研究模型，比较了EGFR介导的途径中四种EGFR抑制剂的功效，包括 不 可 逆 抑 制 剂 3 2 4 6 7 4 、 常 规 可 逆 抑 制 剂AG1478、双重EGFR/HER2抑制剂GW583340和pan-EGFR/ErbB2/ErbB4抑制剂。发现在四种抑制
剂中，不可逆EGFR抑制剂32467可以抑制EGFR激活，在抑制HT29和SW480细胞增殖中更有效，能够在较低浓度下有效诱导凋亡。而AG1478、GW583340和pan-EGFR/ErbB2/ErbB4抑制剂不能抑制EGFR表达。因此，不可逆EGFR抑制剂324674
可能在结肠癌治疗中具有治疗应用。

1.2 单克隆抗体

众所周知，结肠癌的主要治疗是手术切除瘤灶，但是转移性结肠癌(metastatic colorectal cancer,mCRC)往往没有行手术切除的指证。目前，不可切除的mCRC患者的治疗包括传统的细胞毒性化疗和新的生物制剂。新的生物制剂用于调控肿瘤生长、耐药性、转移扩散、血管生成和凋亡，单克隆抗体也由此产生。 2004年西妥昔单抗作为第一个被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准的靶向药物作用于RAS野生型mCRC患者， 2周后，贝伐单抗也已被批准。
从此以后，单克隆抗体药物的研发引起了越来越多的关注和重视，相继出现的几种药物也已经被FDA批准(图1)。这些药物主要分为两类(表1)。

1.2.1 抗血管生成抑制剂

抗血管生成抑制剂是一种抑制肿瘤新生血管生长的物质，为癌症治疗开辟了新的途径。新生血管生成是一个复杂的过程，在肿瘤的生长和发展中起着至关重要的作用。促进血管生成的因素包括生长因子、趋化因子以及生成血管的各种酶。其中VEGF信号通路对血管新生的整个过程进行调节，发挥了无可替代的作用。 VEGF家族由六
个成员组成： VEGF-A(即通常所指的VEGF)、VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E和胎盘生长因子。目前，贝伐单抗、阿柏西普、瑞戈非尼和雷莫芦单抗是四种已被FDA批准的血管生成抑制剂，可靶向肿瘤血管生成并主要作用于VEGF或其受体(表1)。贝伐单抗是第一种抗血管生成抑制剂，为科学家开辟了抗肿瘤的新途径，可以抑制VEGF活性。研究表明，在接受治疗的病人中无进展生存期和总生存期得到了显著的改善，贝伐单抗与化疗联合使用作为一线或二线治疗方案，可不同程度延长晚期结肠癌患者生存时间[36-37]。阿柏西普是一种重组人融合蛋白，它主要是抑制VEGF的A型和B型以及胎盘生长因子，比贝伐单抗有更广泛的作用机制。瑞戈非尼是一种口服多激酶抑制剂，在临床前研究中，能够抑制促血管生成VEGF受体酪氨酸激酶。雷莫芦单抗是靶向细胞外结构域VEGFR-2的单克隆抗体，阻断VEGF信号级联反应。

1.2.2 EGFR抑制剂

EGFR抑制剂的代表药物包括西妥昔单抗和帕尼单抗。西妥昔单抗是一种抗mCRC的嵌合(小鼠/人)单克隆抗体。它最初被FDA批准作为单独用于难治性mCRC治疗的三线药物，西妥昔单抗联合伊立替康与单用西妥昔单抗相比，联用疗效优于单一使用，西妥昔单抗能够克服患者对伊立替康的耐药性，明显提高生存质量。帕尼单抗是完全人源化的单克隆抗体，这两种药物可以抑制EGFR信号传导的下游通路，调节细胞分化、增殖、迁移、血管生成和细胞凋亡。

2 基因靶向治疗

目前肿瘤的基因治疗手段主要包括基因沉默治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗等，而目前实际应用过程中最关键的问题是缺乏高效、导向的载体系统和基因导入后的有效调控，所以基因靶向递送系统成为近年来的研究热点。已经开发的递送系统包括病毒和非病毒载体。病毒载体可以实现高效的基因转移，但会引起机体免疫反应的风险。相比之下，非病毒载体可通过阳离子脂质体介导进行转染，例如作为基于阳离子聚合物或高分子胶束的载体，脂质体已被报道能够以非常少的免疫毒性抑制靶基因，并且成为良好表达小干扰RNA(small interferingRNA, siRNA)的载体[43]。研究发现，聚乙二醇(polyelectrolyte complex, PEG)等聚合物可与siRNA结合，进一步提高静脉内给药后的稳定性和延长其血液循环时间[44]。 Zhu等设计并开发了一种递送系统， p85嵌段共聚物，结合5-Fu用于抑制结肠癌的生长和转移。

近几年的研究中， Kiani等使用PEC纳米颗粒作为注射或口服基因递送系统，将hSET1反义载体载入PEC纳米颗粒中以抑制结肠癌细胞系的增殖，制备的纳米颗粒的优点是高效的细胞穿透性和对SW480结肠癌细胞增殖的抑制作用。 Liang等构建了F-PLP/pIL15， FRα靶向的脂质载体重组白细胞介素-15质粒(interleukin-15 plasmid, pIL15)。研究了其在体内使用CT26结肠癌小鼠模型的抗肿瘤作用。观察到IL15基因的靶向递送可能与其体内抗肿瘤作用相关，包括抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，促进免疫细胞如T细胞和天然杀伤细胞的活性。最重要的是，在F-PLP/pIL15治疗后，除了苏木精和重要器官的伊红染色外，没有观察到可检测的毒性。表明这种治疗的腹膜内给药是安全的， F-PLP/pIL15可被认为是结肠癌治疗的潜在靶向制剂。

Song等构建了β6-siRNA的靶向递送系统特异性脂质体，用于结肠癌中β6-siRNA的高效率和选择性递送，从而抑制导致结肠癌细胞的生长、侵袭和转移。在Yu等[49]的研究中开发了一种基于新合成的共聚物COOH-PEG-PLGA-COOH (CPPC)的新型基因递送系统，该结构能够克服病毒载体、阳离子聚合物、脂质体的缺点。该研究组制备以重组人色素上皮源生长因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)为基因载体的CPPC纳米粒子(CPPC nanoparticles, D-NPs)，并发现经过D-NP处理的两种细胞系C26和A549在体外具有抗肿瘤作用。此外，还通过静脉内注射，在C26皮下肿瘤
模型中研究其D-NPs的体内抗肿瘤活性，并证明D-NPs具有显著的抗肿瘤活性，降低微血管密度并促进肿瘤细胞凋亡的作用。在体外和体内血清学和生物化学分析中也没有观察到D-NPs具有明显的毒性作用。因此，新型CPPC纳米颗粒是用于系统递送PEDF基因的理想载体，可能是潜在的基因递送系统。

最新一项研究发现，从食用生姜中分离出一类特定的纳米颗粒，并且利用这些纳米颗粒让食用生姜中的脂质重新组装，从而形成生姜源性纳米脂质，也被称作纳米载体(nano vector)。并利用叶酸(folic acid, FA)对这些纳米载体进行修饰而构建出经过叶酸修饰的纳米载体。其中叶酸受体在很多肿瘤细胞表面上高水平表达，而在非肿瘤细
胞表面上几乎是检测不出来的。这些源于食物的叶酸纳米载体被作为阿霉素(Doxorubicin, DOX)治疗结肠癌的递送平台，提示着这种运送策略能够降低阿霉素的副作用。该项研究表明，开发可食用、无毒性的理想载体将得到广泛研究。