简介
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这是一种莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶(简称M-MLVRTase),这个酶已经作了遗传性上的改变,即除去了与它联在一起的核糖核酸酶H活性(一种专门切割DNA与RNA杂交链上
RNA分子的酶)。这个酶应用于cDNA的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子,当以mRNA为模板时,先合成单链DNA(ssDNA),再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下,以单链DNA为
模板合成“发夹”型的
双链DNA(dsDNA),再由
核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此,反转录酶可用来把任何
基因的mRNA反转录成cDNA
拷贝,然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的
分子探针。
逆转录酶(M-MLV)从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来,可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失,所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同,同时其延伸能力也有显著提高。逆转录酶(M-MLV)一个活性单位定义为在37℃,10min条件下,使1nmol的
脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。
合成步骤
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1、使用前每个组份轻轻混匀,然后2000rpm
离心20s
2、取灭过菌且无
核酸酶的0.2ml
离心管,依次加入2~5μgRNAnμL
3、65℃保温5min,然后冰浴5min;
4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份
10×M-MLVReactionBuffer2μL
DTT(200mM)1μL
5、轻轻混匀后,然后2000rpm离心20s;
6、先在37℃保温1hr,然后70℃保温15min;
7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。
主要特点
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多反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性[1]。
①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高[1]。
②RNase H活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子[1]。
③DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子[1]。
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