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一、酵母人工染色体(Yeast artificial chromosomes YACs) YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等,以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时,可抑制 ade 2-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。 二、细菌人工染色体载体(Bacterial artificial chromosomes,BACs) 1.F 质粒 大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质(Willetts and Skurray,1987)。虽然F因子通常以双链闭环DNA(1-2个拷贝/细胞)的形式存在,但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合(Low,1987)。携带F因子的细胞,或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 2.细菌人工染色体 是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的,高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记,一个来源于大肠杆菌 F 因子(致育因子)的严谨型控制的复制子 oriS ( Shizuya et al. 1992 ),一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶( (RepE) 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 ( parA , parB , 和 parC ) 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生,减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 第一代 BAC 载体 (Shizuya et al. 1992) 不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子,并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 (Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997) 。 Not Ⅰ 识别序列,位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ 消化后,可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子,用于插入片段末端测序。图 3-28 是 pBeloBAC11 遗传结构图。 BAC 与 YAC 和 PAC(P1 artificial chromosomes , P1 人工染色体 ) 相似,没有包装限制,因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ,然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。 F 质粒能够编码形成性菌的蛋白,通过大肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。 BAC 载体空载时大小约 7.5kb ,在大肠杆菌中以质粒的形式复制,具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上,通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互补筛选。 三、P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体 1.P1 噬菌体载体(Bacteriophage P1 vectors) 是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的,与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件,能容纳 70~100kb 大小的基因组DNA片段(Sternberg 1990, 1992, 1994) 。在这种系统中,含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中,后者总容量可达 115kb (包括载体和插入片段)。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中,线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外,载体还携带一个通用的选择标记 kan r ,一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子( P1 裂解性复制子)在可诱导的 lac 启动子(IPTG 诱导)控制下,用于 DNA 分离前质粒的扩增。图 3-29 是 P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构图。 2.P1 人工染色体(P1 artificial chromosomes) 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性,包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外,在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中,并且以单拷贝质粒状态维持 (Ioannou et al. 1994) 。代表性 PAC 载体 pCYPAC1 遗传结构图 见图 3-30 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb~150kb 之间。 |
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