大肠杆菌表达系统研究的新进展
近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。
在大肠杆菌中表达的目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体，这使大肠杆菌表达系统的应用范围受到了很大限制，虽然到目前为止大肠杆菌细胞内可溶性表达问题还没有完全解决，但也取得了不少研究结果和进展。包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶和硫氧环蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要由多个蛋白因子共表达才能达到预期的目标（Machida et al.，1998；Caspers et al.,1994）。
大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA和DsbB二个蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。已有报道发现来源于人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）在大肠杆菌细胞内共表达可以二硫键的形成和正确折叠（Ostermeier等，1996；Humphreys等，1995）。对PDI在大肠杆菌中的功能研究表明，PDI对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用可以受到谷胱苷肽的调节。这些研究结果表明真核生物的PDI在大肠杆菌中的功能是依赖于大肠杆菌自身的氧化还原体系的。PDI具有的二硫键异构交换功能有效地弥补了DsbA和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的比例。
目标蛋白在大肠杆菌中分泌表达具有许多优点，但由于大肠杆菌自身的蛋白分泌系统不够完善，分泌目标蛋白的能力与其它一些原核生物相比要微弱的多。以前的研究工作主要集中在宿主菌改造，共表达与分泌过程相关的蛋白因子和培养条件的优化上，随着基因突变技术的发展，近期不少研究工作都围绕着改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率这一角度展开。比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酶基因phaA信号肽的疏水区置换为多聚亮氨酸残基能明显提高分泌效率（Rusch等，1994）。表明信号肽核心部位的疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好的参考依据。
随着信号转导研究的深入，膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点领域，到目前为止已有几十种膜蛋白在大肠杆菌中成功表达，其中大部分是受体或受体的亚基。膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面表达技术的建立。外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程度上能与噬箘体展示系统相媲美。因此大肠杆菌表面表达技术近年来得到了较快的发展，主要通过三条途径使目标蛋白呈现在菌体表面：（a）把外源蛋白插入外膜蛋白的膜外区；（b）把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构中；（c）在脂蛋白、IgA蛋白酶的N端或C端融合外源基因。前两种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的外源序列，第三种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小，其序列可在50－500氨基酸残基长度的范围内。
由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工体系相当不完善，因此不能对重组蛋白质进行修饰加工，这是大肠杆菌系统与其它表达系统相比存在的一个比较突出的缺陷。蛋白质C末端酰胺化和侧链糖基化是常见的翻译后修饰加工类型，目前C末端酰胺化一般都是在体外通过肽酰甘氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸转换为胺基，来自有爪蟾蜍的肽酰甘氨酸酰胺酶基因已克隆并在哺乳动物细胞表达系统获得表达，把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺酶，真核生物糖基化过程所涉及的酶系导入大肠杆菌的设想很早就被提出，但这些工作都还在探索之中。其中需要研究的主要问题有：如何使肽酰甘氨酸酰胺酶在大肠杆菌中有较高的活力和专一性；如何通过基因工程技术改造真核生物的糖基化多酶体系使其能整合到大肠杆菌的染色体中和对糖基化位置和糖基种类和长度进行控制等等。关于表达产物的构象、分泌、定位和修饰加工研究是今后大肠杆菌表达系统研究的重点方向。
