编者按：6月11日，Nature子刊 Nature Medicine上同期发表了两篇关于抑癌蛋白p53对CRISPR在人多能干细胞中进行基因编辑的影响：CRISPR基因编辑造成的DNA双链断裂会激活p53，引起人多能干细胞的凋亡。而最后被“筛选”存活的细胞，很有可能存在p53功能缺陷——多种恶性肿瘤的特征。这种细胞在移植入体内后很可能具有极高的致癌风险，虽然尚无直接实验证实其致癌性。
这两篇文章为CRISPR的安全性再次敲响警钟。这提醒我们，在应用于人体之前，CRISPR还有一段路要走。未来使用其他种类的Cas9蛋白，或是选择性暂时抑制p53活性有可能会解决这个现在棘手的问题。
CRISPR 技术曾一度被认为前景无量，也因为其高精确度和快速的特点被无数人看好，希望它可以为基因治疗带来新曙光。然而，随着各种试验的开展，越来越多的科学家开始质疑这项技术的副作用。
继去年5 月底 Nature 子刊 Nature Methods 发表的一篇文章表明“基因编辑技术有可能会在引起基因组内数百种尚不确定的基因突变”后（于今年 4 月 27 日撤稿），6 月 11 号，发表在 Nature Medicine 两篇文献接连报道 CRISPR-Cas9 成功编辑的人多能干细胞可能存在致癌风险。CRISPR-Cas9 的致癌性仍未得到直接验证，但是，此次研究引发科学家关于该技术仍需优化的讨论。
与此前 Nature Methods 那篇基于小鼠数据的实验结果不同，这两篇均是来自于人多能干细胞的实验结果，这无疑给开发 CRISPR 基因编辑疗法的企业当头一棒。受此影响，CRISPR Therapeutics 股价在 6 月11 日暴跌，至今日仍未见明显回转。
图 | CRISPR Therapeutics 股价走势（图源：Google Finance）
根据论文，瑞典卡罗林斯卡研究所（Karolinska Institutet）和诺华（Novartis）的研究人员科学家们发现，使用 CRISPR-Cas9 成功编辑的多能干细胞很可能有 p53 缺陷，这将增加肿瘤风险。按照他们的说法，“这些基因编辑细胞就仿佛是定时炸弹一样”。
在这次的挑战之前，CRISPR 技术曾逃过两次大劫——一是该技术曾被控告脱靶率出奇高，但此控告在 2017 年 4 月被撤回，二是人体对 Cas9 的免疫应答存在问题，最终却被敷衍为“可解决的”。不过，对于 6月11日发表的实验结果，我们目前还无法做更多确认。
CRISPR Therapeutics 公司的 CEO Sam Kulkarni 表示，这些结果“看起来是有道理的（plausible）”。尽管这些研究主要集中于用正常基因取代致病基因的应用，而非 DNA 序列剪切，他还说：“这是我们该重视的地方，尤其是现在 CRISPR 疗法被应用于越来越多的疾病中。我们要确保这些编辑过的细胞不会在返输回体内后成为癌细胞。”另一位该领域的领军科学家（其与某基因编辑公司有密切关系，因此不便透露姓名），认为这两项研究“十分震撼人心”，并且对曾经疏忽了这一方面的 CRISPR 疗法表示了担忧。
图 | CRISPR 基因编辑的几种方式（图源：CRISPR Therapeutics）
另一方面，马萨诸塞大学医学院（University of Massachusetts Medical School）的 Erik Sontheimer 说，其实来自诺华的那篇文章初稿自去年暑期就已经发布了预印本，但是当时 CRISPR 界的专家们并没有“惊慌失措”。他本人的研究方向是探究 CRISPR 技术的新型酶和脱靶效应。他还提到：“这是一件值得注意的事，但我觉得这并不意味着 CRISPR 技术无法应用到疾病治疗中。”
卡罗林斯卡研究组和诺华研究组分别在人类视网膜细胞和多能干细胞中对 CRISPR 进行了试验。两种细胞中的实验结果是类似的，这引起了研究人员的重视。典型的 CRISPR-Cas9 的工作原理涉及剪切双螺旋 DNA 链的两条链，这导致细胞内“急救基因” p53 的活化：修复 DNA 断裂或者导致细胞“自杀”。然而，不论是哪种途径，p53 活化的结果将使 CRISPR 技术无法发挥作用，因为剪切后的 DNA 链不是被重新连接起来就是细胞死亡。诺华研究组还证明 p53 基因的活化使得 CRISPR 在多能干细胞中的效率降低了十七分之一。这大概就解释了为何 CRISPR 技术效率极低，即使是在病毒载体的帮助下，也只有极少数细胞的基因组被成功编辑。
图 | 肿瘤抑制蛋白 p53（图源：Wikipedia）
“我们发现 CRISPR-Cas9 剪切基因组时会活化 p53，”卡罗林斯卡研究组的第一作者 Emma Haapaniemi 如是说，“这使得基因编辑变得更加困难。”
换一个角度思考，细胞能被 CRISPR 技术成功编辑，是因为 p53 功能的失常导致细胞失去修复 DNA 的能力和失去程序性死亡的能力。但问题是 p53 功能失常也意味着癌症的发生，并且这不是一个偶然的现象：几乎一半的卵巢癌患者，43% 的结直肠癌患者，38% 的肺癌患者，将近 1/3 的胰腺癌、胃癌和肝癌患者，以及 1/4 的乳腺癌患者都具有 p53 突变。
诺华研究组最初的研究目的是探究如何增加 CRISPR 编辑多能干细胞的效率，因为多能干细胞具有分化成为所有种类细胞的潜能，这样就可以利用基因编辑来治疗各种各样的疾病。该公司在马萨诸塞州剑桥市的研究所的神经科学家 Ajamete Kaykas，成功将 CRISPR 技术编辑人多能干细胞 DNA 的效率提到 80%。然而，不幸的是，大部分细胞最终都没能存活。存活下来的细胞很有可能存在 p53 功能失常，从而引发肿瘤风险。这一结论在文中的 p53 缺陷实验中获得证实。
图 | p53 缺陷的人多能干细胞大多能“熬过” CRISPR 基因编辑，而普通的大部分都凋亡了（图源：Nature Medicine）
因此，诺华组总结道：“确保 p53 在基因编辑前后都有功能这一点非常重要。”卡罗林斯卡研究组也认为在使用 CRISPR-Cas9 技术发展基因编辑疗法的时候需要审查 p53 和其他相关基因仍具有正常功能。
但是，有关 p53 的这个发现并不意味着 CRISPR 就“玩完了”。第一，卡罗林斯卡研究所的生化学家 Bernhard Schmierer 认为，“这两篇文章呈现的只是初始数据，这个发现在临床实验使用的细胞中是否属实还未清楚。”第二，p53 这个问题可能会因为使用其他的 DNA 剪切酶（而非 Cas9）而减轻，此外，其他途径的基因剪辑也可能并不涉及到 p53 活化。
CRISPR 编辑基因的途径有两种。第一种叫做非同源性末端接合 (NHEJ)，或者损伤性修复，即剪切下一大段致病基因，以非同源的碱基补上。这是 CRISPR 治疗镰刀形红细胞病采用的方法。第二种叫做同源性重组修复（HDR），也叫纠正性基因修复，即剪切下致病基因后以同源的正常碱基补上。目前，有几所大学的实验室正在致力于利用 HDR 来治疗一些疾病，如杜兴氏肌肉营养不良症。
图 | 非同源性末端接合与同源性重组修复（图源：Emendobio）
Haapaniemi 说在他们组研究的正常、成熟细胞中，损伤性修复“在 p53 被活化的情况下也会发生。”这对于 CRISPR Therapeutics 镰刀形红细胞病等使用 NHEJ 途径的项目来说是莫大的好消息。但是，美国食品药品监督管理局（FDA）还是在 5 月份暂停了 CRISPR Therapeutics 镰刀形红细胞病的人体研究。不过，p53 这个发现也应该不会影响 Intellia Therapeutics 和 Regeneron 对淀粉样变的研究。
根据相关科学家，宾夕法尼亚大学有关 CRISPR 技术编辑 T 细胞来对抗肿瘤的一项临床试验，也不存在 p53 功能异常这个问题。其他没有将 DNA 双链打断的 CRISPR 基因编辑照理也不应该存在这个问题，如 Beam Therapeutics 的技术——由哈佛大学刘如谦所设计，用正确的碱基替换突变的碱基。
不过，p53 问题确实会影响一些企业开发的治疗方法，即那些使用了 HDR 方法的，包括对肝糖储积症、囊状纤维化和严重复合型免疫缺陷这些疾病开发的产品。
此外，在干细胞中使用 CRISPR 技术也成为一个棘手的问题。诺华研究组表明 p53 失常似乎在 NHEJ 和 HDR 中都是必需条件。这表明在成功编辑了的干细胞内有失能的 p53，而这会导致癌症的发生。
看到这儿，也许你会有疑问，为何以前没有报道过 CRISPR 成功编辑的细胞会致癌？为何在小鼠身上的试验没有出现致癌的结果？
卡罗林斯卡研究组的 Haapaniemi 解释说，这是因为这种效应出现在大型试验中，比如他们组和诺华组，而在小型研究中很容易被忽视，因为人们只关注在一种细胞上编辑一种基因。当问及其他科学家时，她说：“似乎其他研究组目前还没有发现 p53 在基因编辑中扮演的角色。”
来自加州大学伯克利分校的 Jacob Corn 说尽管他们实验室在几次实验中注意到过 p53 突变的迹象，但当他们努力追踪这些血液干细胞在编辑后的生长效应时却一无所获。不过他也表明他并没有理由去怀疑诺华组在多能干细胞中的发现。
至于为何从未有人报道过 CRISPR 基因编辑会导致小鼠致癌，Haapaniemi 说：“这个问题问的好，”其中一个原因可能是，“实验小鼠一般牺牲较早”，肿瘤还来不及发生。
不过，Jacob Corn 说他和其他研究者“已经在探索是否会导致肿瘤，但是目前没有人发现相关的证据。”但是不管怎样，他仍然觉得这两篇文章“相当重要，因为这提醒了每一个人，基因编辑并不是一种奇迹。”
总体而言，随着越来越多研究表明 CRISPR 技术存在弊端，要将这项技术安全而高效地用于临床治疗还有很多路要走。
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校审：戴青
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