一. 教学内容：
动物细胞培养和核移植技术
二. 学习内容：
本周学习动物细胞培养的过程，要区别开较动物细胞培养与植物组织培养异同点，掌握动物体细胞核移植技术的过程和意义
三. 学习重点、难点
了解动物细胞培养的过程。
了解动物体细胞核移植技术的原理。
四. 学习过程：
（一）学习内容
1. 动物细胞培养：胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在培养的过程中不再形成组织。
概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。
培养液的特点：液体培养基、含动物血清。
培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳，动物细胞培养中将培养皿或松盖培养瓶置于95%空气加5% CO2的混合气体的培养箱中进行培养。）等。
基本过程：
取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶处理（消化），处理形成单个细胞，将单个的细胞放入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。
传代培养与原代培养：我们将培养10代以内的培养称为原代培养。10代以后的称为传代培养。培养10~50代的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞被称为细胞系。
技术的应用：a.生物制品的生产 b.转基因动物的培养 c.检测有毒物质 d.医学研究
2. 动物细胞培养与植物组织培养的区别。
动物细胞培养与植物组织培养有许多相似之处，也有许多不同点。一是它们用的培养基不同，植物组织培养用的一般是固体培养基，而动物细胞培养用的一般是液体培养基。第二是它们的培养基的成分不同。动物细胞培养的培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素，另外还有动物血清。植物组织培养所需要的培养基包含植物生长和发育的全部营养成分，如矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物，没有动物血清。第三是植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。
区别：
a. 培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）
b. 培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。
c. 产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。
3. 细胞核移植：将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。
哺乳动物核移植是将外源的一个细胞核与一个去核卵母细胞结合，产生遗传上同质的动物的技术。它在动物育种、制备转基因动物、基因治疗及器官移植等方面具有重大的作用。
A. 供体核的获得：供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎千细胞和体细胞。
早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核。
80年代开始，胚胎干细胞在核移植，但其建系太困难，仅在小鼠上获得成功。胚胎干细胞系克隆小鼠，有29％的重构胚在体外能发育到囊胚阶段，移植给假孕小鼠有8％胚胎附植并产下小鼠。
1997年Dolly羊的出现，开始了体细胞的核移植，并发展很快。
胚细胞
用0.2％链霉蛋白酶预处理胚胎，溶去胚胎的胶膜及透明带，分离出单个卵裂球。消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素，作用时间短，透明带不能充分消化，卵裂球不易获得；作用时间长，则影响到卵质膜，容易破裂，在操作时容易失败。因此，在分离卵裂球时应在解剖镜下监视透明带的消化过程，当透明带变薄，膨胀适度时就应移出，再用适当口径的吸管吹打使之分离。另外，苏格兰学者Campbell等显微分离胚盘细胞并在体外进行缺血饥饿传代培养，诱使细胞处于“静止”状态，以便调整染色体结构，从而有助于核的重组与发育，他们使用这种方法建立了绵羊TNT4细胞系，该细胞形态类似于胚胎干细胞，但更扁平、上皮化。
体细胞
最早用青蛙肠粘膜上皮细胞获得了后代。Wilmut等用绵羊乳腺细胞获得Dolly羊。美国夏威夷大学Ryuzo Yanagimachi教授领导的一个国际科研小组于1998年以小鼠卵丘细胞为核供体，采用吸移管注入，利用机械和化学激活方式进行细胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。对小鼠、牛体细胞移植的相关研究中发现休眠（G0）的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚，其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞，这可能缘于颗粒细胞上存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥的缘故，它或许有助于供体核同受体核胞质因子的交换。
B. 受体细胞的获得及其去核
作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。近来有人用两个去核卵母细胞融合后产生的胞质作为受体进行各代核移植，以增加核移植胚胎的细胞数和提高继代移植效率。研究证明，体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞，其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中，需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂，体外成熟的一些卵母细胞其活动有可能受到抑制。吸核的方法不是将微吸管头刺入供体细胞内吸取细胞核，而是利用显微操纵台通过轻轻地来回转动千分尺外径，将一个细胞慢慢地吸入微吸管。必须注意微吸管的内径要比细胞小，这样能使被吸入的细胞由于吸力的作用而破裂，结果可以依靠目测，将细胞核和包在它周围的一部分细胞质一起吸入管内，避免细胞核直接与液体接触，以免受损。还应调节使供体细胞尽量靠近管口，避免注核时带入较多的手术液。
材料二：胚胎细胞核移植研究进展
卵母细胞的去核方法
盲吸法：用微细玻璃管在第一极体下盲吸，吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质，但该方法成功率低。为提高去核率，利用Hoechst33342染料对染色质的特异性染色作用，在荧光显微镜下去核后判断去核是否完成，去核准确率大为提高。
半卵法：用微细玻管针在透明带上做一切口后，用微细玻管吸去一半染色质至另一半空透明带内，即将卵母细胞分为两半，然后用染色，确定不含染色体的一半为细胞质受体。荧光显微镜下观察不发荧光的作为受体卵母细胞。
离心去核：用链霉蛋白酶去除卵母细胞透明带，经渗透压梯度离心，MⅡ期纺锤体可从大多数卵母细胞中分开，把无透明带的去核胞质作核移植的供质，同分裂球聚集经电融合成核移植胚，最后放入藻酸钠假透明带中，能在体外卵裂和发育，但其效果还有待于进一步研究。
末Ⅱ期去核法：把卵母细胞先激活使之处于末Ⅱ期，在排出第二极体时吸出第二极体及周围的少量细胞质，从而达到去核。这种方法避免使用DNA染料和经紫外线照射来定位染色体，并且去除的细胞质相对较少。该去核方法比MⅡ期去核的成功率有显著提高，但这种细胞质容易老化，是否能对基因组完全重排序，顺利完成后期发育，有待于研究。
有人对核反比例与重构胚发育的关系进行研究，结果表明，卵母细胞去除的胞质量与预期供核体积大小相当时，可以为细胞周期的相互作用创造最好的条件，而去除太少或太多并不理想。基于去除细胞质的量与去核率关系密切，因此，在保证有较高的去核情况下。去除的胞质应尽量少。到目前为止，虽然核移植技术的发展较快，然而该技术还存在许多问题，如核移植成功率普遍比较低、重构胚的发育率低、畸形胚的比率高。体外培养的时间过长或培养液的成份可能导致移植胚的流产以及出生后的仔畜很快死亡。基因重组编程的机制尚不清楚，其中MPF、NEBD（核膜破裂）和PCC在基因组重编过程的作用还需阐明。基因印记对核移植重新编程的影响以及基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系，还不清楚。
4. 把握动物体细胞移植的特点
动物体细胞移植依据的原理还是细胞的全能性，与植物组织培养一样属于无性生殖。虽然细胞核内具有发展成为一个完整个体所需的全套基因，但动物体细胞分化程度较高，因此很难表达全能性。卵细胞体积大，易于操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。将体细胞核移植入去核卵细胞内，既保证了重组细胞的完整性，又能刺激体细胞核表达其全能性，发展成为一个新的个体。动物体细胞移植产生的新个体的亲本有三个：体细胞核供体、卵细胞细胞质供体、代孕母体。新个体细胞核基因型与体细胞核供体完全一样，因此新个体性状与体细胞核供体基本相同。卵细胞细胞质中也有少量的DNA，新个体性状与卵细胞细胞质供体有一些地方相同。代孕母体没有为新个体提供遗传物质，新个体性状与代孕母体基本没有联系。
5. 动物核移植的应用
a. 在畜牧业生产方面：利用体细胞克隆技术可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；
b. 在保护濒危物种方面：利用体细胞核移植技术增加这些动物的存活数量，挽救濒危物种。
c. 在医药方面：
① 利用转基因克隆动物生产珍贵的医用蛋白；
② 利用转基因克隆动物细胞、组织器官作为异种移植的供体，治疗疾病；
③ 利用人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官，用于组织器官的移植；
d. 在科研领域方面：
① 研究克隆动物和克隆细胞，从而更深入地了解胚胎发育及衰老过程；
② 利用克隆动物做疾病模型，使人们更好的追踪研究疾病的发展过程，从而治疗疾病。
6. 研究历程
在1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团的细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功，但其实验未被其他的研究人员所重复。
1983年Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。
1986年，Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体，用去核的第二次减数分裂中期（Second Meiotic Metaphase，MII）卵母细胞作受体，并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞的融合，研究发现电融合方法比病毒融合法更有效，核移植胚胎的体外发育能力更强，重组胚移植后获得了核移植后代，这是首次在家畜上获得了成功。
Willadsen等在实验中阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观点：（1）作为核受体，卵母细胞比受精卵有更大的优越性；（2）绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性，并建立了以早期胚胎卵裂球为供体，MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。
7. 几种哺乳动物胚胎细胞核移植
兔：Stice和Robl（1988）用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内，获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。
猪：Prather等（1990）在研究发现，猪核移植胚发生了发育程序的重排，出现供体核膨胀，并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。2001年 4月，PPL公司宣布他们在去年得到体细胞核移植猪后，又通过体细胞核移植的方法得到了5头带有人类基因的转基因猪，这些猪可望减小与人体器官的免疫排斥反应，为人类提供可移植的器官。
羊：早在1986年，Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体，首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体，并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合，获得了核移植后代。该方法成为以后核移植的常规方法，为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。
【模拟试题】
一. 选择题
1. 下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（ ）
A. 培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清
B. 原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞
C. 动物细胞培养一般能够传到40～50代，但其遗传物质发生了改变
D. 动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞
2. 生物技术的发展速度很快，已灭绝生物的“复生”将不再是神话。如果世界上最后一只野驴刚死亡，以下较易成功“复生”野驴的方法是（ ）
A. 将野驴的体细胞取出，利用组织培养技术，经脱分化、再分化，培育成新个体
B. 将野驴的体细胞两两融合，再经组织培养培育成新个体
C. 取出野驴的体细胞核移植到母家驴的去核卵细胞中，经孕育培养成新个体
D. 将野驴的基因导入家驴的受精卵中，培育成新个体
3. 一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能（ ）
A. 有选择地繁殖某一性别的家畜 B. 繁殖家畜中的优秀个体
C. 用于保存物种 D. 改变动物的基因型
4. 下列哪—项属于克隆（ ）
A. 将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中
B. 将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内
C. 将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
D. 将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系
5. 有关全能性的叙述，不正确的是（ ）
A. 受精卵在自然条件下能使后代细胞形成完整个体，因此全能性最高
B. 生物体内细胞由于分化全能性不能表达
C. 卵细胞与受精卵一样，细胞未分化，全能性很高
D. 植物细胞离体培养在一定条件下能表现出全能性
6. 下列属于组织培养但不是克隆的是（ ）
A. 将花粉离体培养成单倍体植株 B. 芽发育成枝条
C. 根尖分生区发育成成熟区 D. 上皮细胞无性繁殖产生的细胞群
7. 动物细胞培养液和植物组织培养液的共有成分是（ ）
A. 葡萄糖 B. 蔗糖
C. 动物血清 D. 维生素
8. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能存活、增殖的细胞是（ ）
① B淋巴细胞 ② 小鼠骨髓瘤细胞
③ B淋巴细胞自身融合细胞 ④ 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞
⑤ 杂交瘤细胞
A. ①②③④ B. ①③⑤ C. ②④ D. ①③
9. 动物细胞培养的细胞来自于（ ）
A. 任何个体的细胞 B. 只能取自动物胚胎细胞
C. 只能取自幼龄动物的组织细胞 D. 胚胎或幼龄动物的器官和组织细胞
10.（2005，广东）关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是（ ）
A. 可以制成诊断盒，用于疾病的诊断
B. 可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗
C. 可以利用基因工程技术生产
D. 可以在生物体内生产，不能体外生产
11. 动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是（ ）
A. 动物细胞培养 B. 动物细胞融合 C. 单克隆杭体 D. 胚胎、核移植
12. 细胞株的特点是（ ）
A. 遗传物质没有改变，可以无限传代
B. 遗传物质发生改变，不可无限传代
C. 遗传物质没有改变，不可无限传代
D. 遗传物质发生改变，且有癌变特点，可以无限传代
13. 关于杂交瘤细胞的不正确叙述是（ ）
A. 有双亲细胞的遗传物质 B. 不能无限增殖
C. 可分泌特异性抗体 D. 体外培养条件下可大量增殖
14. 动物细胞融合技术最重要的用途是（ ）
A. 克服远源杂交不亲和 B. 制各单克隆抗体
C. 培育新品种 D. 生产杂种细胞
15.“生物导弹”是指（ ）
A. 单克隆抗体 B. 杂交瘤细胞
C. 产生特定抗体的B淋巴细胞 D. 在单抗上连接抗癌药物
16. 在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为（ ）
A. 原代培养 B. 传代培养 C. 细胞株 D. 细胞系
17. 如果用动物的细胞进行克隆实验应该选择的细胞核不能是（ ）
A. 乳腺细胞的 B. 卵细胞的 C. 胃腺细胞的 D. 囊胚时期的胚胎细胞的
18. 为了使用于培养的动物组织细胞分散开以便配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取来的动物组织应选用下列哪种物质处理（ ）
A. 胃蛋白酶 B. 胰蛋白酶 C. 盐酸 D. 胰脂肪酶
19. 下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是（ ）
A. 培养基成分不同
B. 动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C. 动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能
D. 动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株
20. 在克隆多利羊的过程中，下列哪项技术没有运用到（ ）
A. 细胞培养技术
B. 细胞核移植
C. 胚胎移植技术
D. 基因工程技术
21.（多选）美国杜克大学医疗中心的一个研究小组利用成年猪的动脉血管细胞和模拟胚胎环境的新型生物反应器，成功地在实验室里培育出新的动脉血管，这种血管的外形和功能都与真的血管一样，这一研究成果是生物组织培养领域的重大进展，下列关于以上技术的叙述中，正确的是（ ）
A. 属于“克隆”
B. 可能要利用去核卵细胞
C. 关键是激发血管细胞的全能性
D. 关键是激发血管细胞发育成血管的潜能
二. 非选择题
1. 中国科学院动物研究所陈大元研究员带领的科研小组，首先选择了兔子卵细胞作为受体卵。他们采用了两种核移植方法，即电融合法和核直接注射法，把大熊猫的体细胞核移入兔的去核卵细胞质中。经过精心的实验，他们已得到了大熊猫的重构胚。实验结果显示，大熊猫的3种体细胞移植到兔去核卵母细胞中均可以卵裂，并进行早期发育，3种供体细胞核移植的融合率在55%~59%之间；融合后的重构卵进行培养后，囊胚率以乳腺细胞最高，而骨骼肌细胞的最低；重构囊胚细胞的染色体数目为42条，与供体（大熊猫）细胞染色体数目相同，与受体动物家兔的染色体数（44条）不同。经DNA指纹分析，也证明了重构囊胚细胞的遗传特性为大熊猫的遗传特性。实验还证明，卵细胞质使体细胞核去分化不具有特异性。大熊猫异种重构胚能否在寄母子宫着床乃至进行全程发育还是道难题，现正在深入实验。
根据以上材料，回答下列问题：
（1）下面叙述除哪项外都是动物克隆技术的益处？_____________。
A. 探索异种克隆技术，拯救濒危物种
B. 克隆技术与转基因技术结合，使异种器官移植成为可能
C. 克隆技术的重要性在于复制出一个动物或一批生物
D. 克隆技术的研究将帮助人类认识衰老过程
（2）“去分化”是指____________。
（3）细胞分化为囊胚，囊胚由许多细胞构成，其细胞增殖方式为_____________。
（4）科技预测：请预测大熊猫异种重构胚如果着床成功并顺利产生发育，其表现性状可能是________。
A. 大熊猫的特点
B. 兔子的特点
C. 兼有大熊猫与兔子的特点
D. 不具生殖能力
2. 1952~1953年，美国科学家斯提瓦用胡萝卜根的悬浮培养细胞进行人工培养，发现单个细胞能像受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植株。1997年英国维尔穆特等人从白面母绵羊体内取出乳腺上皮细胞静息培养，然后把它的核移入黑面母绵羊去核的卵细胞中形成重组细胞，并将重组细胞培养成胚胎，将胚胎植入另一母羊的子宫内后获得了克隆羊多利。
阅读这段材料后，回答下列问题：
（1）文中的悬浮培养细胞和乳腺上皮细胞均为____________。
（2）斯提瓦的实验证明了____________。维尔穆特的实验证明了_____________。从细胞结构和遗传角度分析，两位科学家实验结论的得出，根本原因在于____________。
（3）斯提瓦和维尔穆特实验的差别在于____________。
（4）维尔穆特的实验技术又称为__________________技术。该技术的经济意义在于：
①_____________；②____________。
3. CCTV一2于2005年4月7日报道，卫生部4月6日发布了《苏丹红危险性报告评估》，报道中提到苏丹红一号是一种人工色素（工业染料），它在人体内代谢生成相应的胺类。科研人员欲采用一定的技术手段探究苏丹红是否对人体有危害。请回答：
（1）根据所学的动物细胞工程知识，你认为采取下列哪种技术手段最合适：
A. 动物细胞融合 B. 动物细胞培养 C. 胚胎移植 D. 核移植
（2）根据上述选择，请你设计一个实验来探究“苏丹红一号”是否对人体有危害。
[1] 该实验的原理是：
[2] 实验方法步骤：
① 材料准备：从医院妇产科获取所需要的原材料组织，浓度为0.09％“苏丹红一号”试剂，高倍显微镜，培养瓶若干，配制好的培养液，剪刀，培养箱，所需要的酶。
② 制备检测细胞：
a. 配制细胞悬浮液：
b. 将悬浮液分装到两个以上的培养瓶中，置于培养箱中培养一段时间。
③ 检测过程：
④ 实验结果观察、分析得出结论。（略）
【试题答案】
一. 选择题
CCDDC ADADD ACBBD DBBAD (ABD)
二. 非选择题
1.（1）C （2）高度分化的组织器官或细胞重新恢复分裂能力的过程 （3）有丝分裂 （4）C
2.（1）体细胞 （2）植物细胞具有全能性 动物细胞也具有全能性 细胞核中具有个体发育的全套基因 （3）动物细胞全能性的证实还需借助于卵子，而植物体细胞直接就可发育成植株 （4）克隆 利用克隆技术繁殖珍稀物种 克隆组织、器官，降低手术费用
3.（1）B（1分）
（2）[1] 原理：许多致畸、致癌物质加入动物细胞培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占观察培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。
[2] ② a.将上述组织用剪刀剪碎，再用胰蛋白酶使其分散成单个细胞，然后利用培养液配制成一定浓度的细胞悬浮液。
③ 检测：取两只培养瓶，标号为1、2，分别往其中加入等量配制好的培养液，再往1中滴加几滴0.09％“苏丹红一号”试剂，摇匀。将上述某一个培养状况较好的培养瓶的细胞培养液分成两份，分别加入1、2培养瓶中，进行培养；一段时间后，分别从1、2培养瓶中取样作多次镜检，计算出变异细胞占观察培养细胞的百分数
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