最近几年最火热的技术中单细胞测序的名字应该排在前列，这项技术在肿瘤，干细胞及发育的领域大放光彩。今天笔者带来一篇国自然单细胞测序的研究文章，关于利用单细胞测序解析肿瘤细胞及肿瘤微环境中免疫细胞异质性的文章。这篇文章发表在Cancer Letters（IF=7.36）上，值得一提的是文章通篇只做了单细胞的生信分析，并没有做任何实验，想想不做实验也能发上7分文章，现在也只有单细胞测序的研究了。
Single cell RNA-seq是一种强大的工具，可用于定义包括肿瘤细胞和肿瘤相关微环境在内的细胞亚型。肿瘤微环境中免疫细胞表型的表征对于了解肿瘤的进展和肿瘤的发病机制也是至关重要的。
1.肿瘤整体分析—鼻咽癌肿瘤细胞间和瘤内表达的异质性
首先作者通过白细胞表面标志CD45对3例鼻咽癌患者肿瘤组织中分离的非免疫细胞和免疫细胞进行了单细胞转录组分析，探讨鼻咽癌组织中肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的细胞异质性和形态，并对肿瘤细胞通过核型将恶性细胞与非恶性细胞区分开来。
之后对恶性细胞进行聚类，发现与EBV阳性（病毒感染）NPC恶性肿瘤细胞相比，EBV阴性恶性肿瘤细胞分离了更多的细胞群，表明阴性患者的肿瘤内异质性很高。上皮细胞黏附分子(EpCAM)在恶性细胞中高表达，在不同亚群中的表达水平不同，这说明了鼻咽癌细胞上皮分化程度、上皮-间充质转化(EMT)调节以及转移的不同程度都有差异。作者分析了肿瘤簇中差异基因，发现一些趋化因子在EBV阳性样本中优先表达，提示对于肿瘤微环境中的炎症和免疫细胞浸润有重要调节。此外一些上皮角蛋白基因，生长因子，蛋白酶体的差异表达也反映了肿瘤间的异质性。
作者想要利用基因集变异分析(GSVA)来了解鼻咽癌患者之间肿瘤表型和一些关键信号通路的表达模式的差异。与EMT相关的基因在EBV阳性亚群中显著高表达，表明亚群正在经历活跃的EMT过程。然而另一个EBV阳性的亚群EMT相关的基因表达较少，增殖基因表达较多，可能处于EMT的不同状态。EBV阳性亚群还有显著的高侵袭和转移以及高血管生成基因表达，这表明该亚群中的恶性细胞可能具有更高的转移能力。之后作者分析了细胞周期相关基因，结果并没有显著的肿瘤间异质性。
肿瘤免疫通过缺失或下调肿瘤HLA（人类白细胞抗原）在恶性肿瘤细胞中的表达来逃避T细胞的识别和激活。分析表明，与NPC7相比，NPC9和NPC16中HLA-I类肿瘤抗原和TAP1的表达减少或缺失，表明NPC9和NPC16患者免疫逃逸能力强，预后更差。
2.进一步细胞群体分析—肿瘤浸润性免疫细胞的异质性
为了探索鼻咽癌微环境中免疫细胞的多样性，作者分析了CD45+免疫细胞的数据，结果发现浸润的免疫细胞主要分四类，T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)。每个簇亚群都有不同患者的细胞，并且肿瘤浸润性免疫细胞的比例和组成在不同的患者之间是不同的。在EBV阳性的亚群(NPC16和NPC7)中，T细胞较多，而在EBV阴性的NPC9亚群中，B细胞为主。这些结果表明，肿瘤浸润性免疫细胞对抗肿瘤效应的调节以及TIL在鼻咽癌发生中的作用是复杂多样的
3.更进一步细胞亚群分析—鼻咽癌中与特殊T细胞簇唯一相关的基因
作者进一步将样本中的主要T细胞群分为五个亚群，其中C0群为调节性T细胞(Treg)，C1和C3为常规CD4+T辅助细胞(Tconv)，C2为细胞毒性CD8+T细胞，C4为自然杀伤T细胞(NKT)。随后作者分析了T细胞亚群功能相关基因，鉴定了T细胞的功能多样性。CD8+T细胞高表达细胞毒性效应分子和细胞因子，常规CD4+T细胞(C1和C3)高表达天然标记基因并且C3簇为耗竭的辅助细胞，而在Treg细胞中高表Treg标记和相关基因。因此，在肿瘤微环境中，这三个CD4+T细胞群中的T细胞可能在不同程度上调节CD8+T细胞的功能。
4.更进一步细胞亚群分析——鼻咽癌微环境中T细胞受体（TCR）的多样性和克隆扩增
与B细胞产生抗体的多样性相似，TCR多样性主要来源于单个T细胞的V(D)J重组。作者从3例鼻咽癌患者的肿瘤样本中对CD45阳性免疫细胞分选，并使用SMART-SEQ2分析，之后分析全长TCR的α和β链序列，根据示踪法组装的成对TCR序列，跟踪每个单个T细胞的命运并评估它们的克隆性。结果显示60-80%的T细胞有至少一个生产性α链或β链，17-32%的T细胞具有成对的生产性α和β链，表现出显著的异质性。同时作者发现鼻咽癌患者肿瘤浸润性T淋巴细胞内有克隆性扩增的证据，而且扩增的克隆型在每个患者中的扩增程度和分布是不同的，TCR多样性分析说明了不同患者之间多克隆T细胞活化和异质性。
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