外泌体研究日益火爆，其主要思路就是在原来的分子研究基础上加入外泌体分离、鉴定、功能验证环节，呵呵呵，一般来说是这样子的。
今天我们就来看一篇复旦大学附属中山医院，心内科葛均波主任的一篇关于外泌体在血管疾病中的研究。
Exosomes derived from mature dendritic cells increase endothelial inflammation and atherosclerosis via membrane TNF-α mediated NF-κB pathway.（J. Cell. Mol. Med IF 4.8）
下载链接：http://pan.baidu.com/s/1slWya09
还记得第四季，我们也讲过一篇DC细胞与外泌体相关的文章吗？
那篇文章讲的是肿瘤细胞来源的外泌体能引发肿瘤抑制，主要是通过DC细胞摄入外泌体。这篇文章是讲的是DC细胞分泌的外泌体能引起内皮炎症及动脉粥样硬化。DC细胞在这两篇文章中所参与的功能不同。
本文结合了两个热点：DC细胞、exosomes
1成熟的DC细胞促进内皮炎症，并且外泌体参与该过程
DC细胞是一类免疫细胞，作为一个炎症细胞分泌细胞因子。
GW4869是一个外泌体分泌抑制剂，通常用来减少DCs细胞外泌体的释放。
滤膜系统（transwell system），该滤膜能阻止比外泌体大的囊泡转移。
作者通过滤膜系统共培养DC细胞和内皮细胞，发现DCs细胞能促进内皮炎症反应，而GW4869能减弱这种作用。这表明成熟DC细胞在促进内皮炎症的功能上有外泌体参与。
2 培养DC细胞，分离鉴定外泌体
为了实验的严谨性，排除可能是由胎牛血清中来源的外泌体，作者先从无血清培养基陪养DC细胞，确保外泌体的来源确实是DC细胞。通过一定时间的培养，最终通过流式细胞仪检测了相关DC细胞marker，qPCR、Elisa检测了相关细胞因子，确定了培养的细胞为DC细胞。
这里作者使用了Exo-Quick外泌体分离试剂盒，进行外泌体分离。通过电镜分析，所获得的囊泡大小在109nm，符合外泌体的典型大小特征。并且检测了一些外泌体相关marker，确定了分离的囊泡为外泌体。另外，作者检测了外泌体阴性marker，钙连接蛋白来说明分离纯度。这些数据都表明了从DC细胞中成功分离了外泌体。
3 外泌体功能验证
首先，在DC-exos上加上一个绿色荧光标签，把它跟内皮细胞共同孵育，发现内皮细胞很快就能摄入加了标签的外泌体，并且随着时间的推移，内皮细胞能摄入越来越多的DC-exos。
实验发现，成熟的DC外泌体能激活上皮细胞一些炎症相关因子表达，而不成熟的DC细胞则起不到这样的作用。
前期报道，DC-exos能通过膜TNF-α或携带的miRNAs来影响靶肿瘤细胞，而TNF-α能通过NF-κB通路激活内皮细胞。另外LPS也能激活内皮细胞。
实验表明，LPS处理内皮细胞，能很快提升p-p105水平；DC-exos也能较快提升p-p105水平，这表明DC-exos能通过NF-κB通路激活内皮细胞，这可能与外泌体膜蛋白及其受体相关。
接下来，作者做了一个时间相关性实验。发现，LPS、DC-exos都能很快上调p-p105水平，激活内皮细胞，而且分别在4h（小时）时达到峰值。
4 TNF-α定位与功能验证
TNF-α定位于胞膜，并且实验表明，相对于不成熟的DC来源的外泌体，成熟的DC-exos含有更多的TNF-α（这也就表明了为什么不成熟的DC 细胞外泌体不能激活内皮细胞！）
通过干扰成熟DC细胞的TNF-α，发现其激活的内皮细胞中粘附分子、p-p105表达量降低了；并且通过抑制TNF-α活性抗体孵育DC细胞，也能发现其激活的内皮细胞中粘附分子、p-p105的表达降低。这表明，DC-exos膜高表达TNF-α能快速激活内皮细胞。
5 外泌体动物实验
小鼠实验过程跟细胞实验一样，开始先验证了动脉内皮细胞摄入实验标记的外泌体。
通过每周一次注射20μgmDC-exos，持续12周，能增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化损失。
该文章，逻辑性很好。先验证了DC细胞功能，从外泌体抑制剂引发关注外泌体参与DC细胞功能。随后分离、鉴定外泌体，验证外泌体功能，最后是动物实验，整个实验内容比较顺畅。机制部分未做，这也给后续埋下伏笔。
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