细胞凋亡中，基因组DNA双链断裂或单链断裂而暴露大量的粘性3'-OH末端，可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测细胞凋亡情况。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
前面我们介绍了Tunel检测样本的制备以及样品进行透膜处理，今天继续为大家介绍Tunel的标记与检测。
首先在进行Tunel检测过程中，我们需要设置四组：
（1）阳性对照：DNA酶I（DNase I）处理制备阳性对照载玻片。DNase I可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶，人为造成细胞凋亡。
（2）阴性对照：使用不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶。
（3）实验处理组。
（4）实验对照组。
标记与检测步骤：
1.阳性对照制备：按1:10的比例用去离子水稀释10×DNase I Buffer，取其中100 µl滴加到已通透的样本上，室温孵育5min。向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I (1U/μl)。洗掉液体，加入100μl含DNase I的缓冲液，室温孵育10min。洗掉液体，并将载玻片放入超纯水中洗涤3次。
2．按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer。将四组样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer覆盖样本区域（可用组化笔将样品圈好），室温孵育10-30分钟。
3.配制Tunel检测液：Tunel检测液按照下列表格配置，检测液需充分混匀。同时配制好的Tunel检测液必须一次使用完毕，不能冻存。阴性对照组配置过程中不加TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶。
组分：总体积（50μl体系）
（1）ddH2O：34μl
（2）5× Equilibration Buffer：10μl
（3）FITC-12-dUTP Labling Mix：5μl
（4）Recombinant TdT Enzyme：1μl
4.将载玻片上的100μl 1×Equilibration Buffer洗掉，再加入50μl TdT孵育缓冲液.
5.将载玻片置于湿盒内，在37℃避光孵育60min。后续步骤注意避光操作。
6.将载玻片置于PBS溶液中室温孵育5min,重复一次。
7..轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。为了降低背景，载玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5min，这样可将游离的未反应标记物清除干净。
8.染核：向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光。避光孵育5-10min。
9.使用PBS轻洗玻片3次，每次5min，洗去多余的DAPI。
10.用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择对应的激发光源。DAPI/Hoechst能将细胞核染上蓝色荧光，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色（或者红色）荧光。
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