做科研实验,计算是一个十分重要的过程,这关系到整个实验的成功与否。比如摩尔浓度(mol/L)和溶质质量(g),OD260的换算等,而牢记一些常用的小公式和换算单位就可以解决大部分计算问题!
1.单位换算
1ng=10-3ug=10-6mg=10-9g=10-12kg
1cm3=10-3dm3=10-6m3=1mL=10-3L
1kDa=103Da
2.摩尔浓度(mol/L)和溶质质量(g)
m (g) = 摩尔浓度(mol/L) x V溶剂 (L) x M溶质 (g/mol)
1M=1mol/L
3.稀释倍数(n)和稀释液体积(V)
稀释倍数n =(终浓度×终体积)/(原液浓度×原液体积)
稀释液体积=终体积—原体积
4.OD260的换算
CDNA/RNA (μg/ml) = OD260值×换算系数
1 OD260 unit=50μg/ml,dsDNA
1 OD260 unit=40μg/ml,ssRNA
1 OD260 unit=33μg/ml,ssDNA
这里的μg/ml也就是ng/μl,所以和Nanodrop测出来的单位是相同的。值得注意的是,这里的每一个OD260对应的核酸浓度只是估算值,毕竟碱基组成不同也会造成折光度的差异,所以在有的网站上,这三组值也会略有差异。
5.核酸碱基对与分子量的换算
核酸碱基对与分子量的换算
1Kb dsDNA (Na+)=6.6×105Da
1Kb ssDNA (Na+)=3.3×105Da
1Kb ssRNA (Na+)=3.4×105Da
脱氧核苷酸的平均分子量=324.5 Da(~330Da)
6.引物量的计算
(1)引物浓度=pmole(绝对数量)/μl
例:100μlPCR反应液中含20pmole引物=0.2μM
(2)引物绝对数量(pmole)=重量(μg)×106/(引物长度×327)
例:0.1μg的20个核苷酸的寡聚物含有的引物绝对数量是:0.1μg×106/(20×327)=15.3pmole引物
7.将蛋白质换算成DNA的长度
分子量1000Da的蛋白质=270bp DNA
分子量37000Da的蛋白质(对应编码333个氨基酸的能力)=1000bpDNA
分子量100000Da的蛋白质=2.7kbDNA
8.核酸分子量计算方程式
吸光度(A)=摩尔消光系数×浓度×长度
500 bp的双链DNA=325,000 Daltons
500 nt*的单链DNA=162,500 Daltons
*nt = nucleotide
dNMP的平均分子量=325 Daltons
9.细胞因子活性单位换算
通常在细胞因子的活性检测中1unit=1ED50
例:某细胞因子ED50=1.0ng/ml, 则1.0ng/ml相当于1 unit,那么1 mg这个细胞因子中含有多少个units呢?用下面的计算公式即可算出:
所以1mgPDGF-BB中含有106Units
备注:ED50是Effective Dose 50的缩写,中文意为“半数有效浓度”,是可诱导50%最大反应的细胞因子浓度。
10.寡聚体定量
20-mer,A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体:5 nmol = 33 µg/(20×325)
40-mer,A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体:2.5 nmol = 33 µg/(40×325)
11.寡聚体DNA分子量(MW)的精确算法
一般而言,寡聚体DNA的精确分子量可根据下述公式进行计算:
MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61
例:TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG
A=1 C=3 G=11 T=6
MW =(1×312)+(3×288)+(11×328)+(6×303)-61 =6541
12.A260单位(核酸OD值)的换算:
1A260(1 OD)单位的双链DNA=50ug/ml
1A260(1 0D)单位的单链DNA=40ug/ml
1A260(1 OD)单位的单链RNA=40ug/ml
1A260(1 OD)单位的寡核苷酸=33ug/ml
例Ⅰ:取某DNA样品溶液5ul,加水至1000ul,在UV260nm时,测得的OD值是0.2,问原溶液中的DNA浓度(ug/ul)是多少?
解:0.2×50ug/ml=10ug
这表示5ul样品溶液共有10ug DNA,所以该样品DNA浓度应是:
10ug/5ul=2ug/ul
13.PCR扩增反应引物浓度的计算
引物毫摩尔浓度(mM)= pmoles/µl
例1:100µl PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM
例2:引物为24bp,并溶解于0.1ml µl H2O中;
10µl溶液稀释至1.0ml测定其A260为:A260 = OD260 = 0.76;
则贮存液在260nm(A260)的吸光度为76;
0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260;
引物碱基组成为:A=6, C=6, G=6, T=6;
260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600)
注:a、b、c、d分别是 A's、G's、C's、T's的碱基个数;
PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600
则PCR引物贮存液的摩尔浓度为:76/267,600 = 284 mM
14.DNA溶液纯度测定
一般情况下,应用紫外分光光度计测定DNA溶液在A230、A260和A280下的吸收光值,便可以很好地确定DNA溶液的纯度,通常只测A260和A280两个吸收光度便可满足要求。因为纯的DNA溶液其A260/A280的比值约为1.8-1.9,而其A260/A230的比值则应大于2.0,所以当:
a. A260/A280>1.8时,表明RNA污染严重
b. A260/A280<1.6时,表明有明显的蛋白质或苯酚的污染
c A260/A280<2.0时,表明溶液中有残存的核苷酸、氨基酸、酚、盐等小分子杂质
这样的DNA样品溶液需重新处理:
在a情况下,可考虑用RNA酶处理之,在b和c的情况下,可考虑用蛋白酶K以酚/氯仿抽提,乙醇沉淀重新处理样品。在SDS和EDTA的存在的条件下,proteinase K仍具有很高的活性,因此在DNA降解酶活力被抑制的情况下,使用proteinase K仍可以消除蛋白质,为制备高纯度高分子量的DNA制品创造了条件。
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