免疫表型

单独用形态学检查对淋巴瘤和白血病细分亚型往往不够，常常需要做免疫表型检查。免疫组化（IH）是为达到这一目的最常采用的技术，因为它提供了直接与形态学相关的标记，因此病理医生感到更有信心作出诊断。此外，免疫组化染色可以手工完成，而且通常不需要昂贵的设备。在存档材料上能够回顾性地进行免疫组化，也是它很大的一个优势。

在现阶段，免疫组化的应用受到能用于组织学染色的单克隆抗体的限制。经固定和包埋后，许多抗原表位已经改变，因此它们不再与可用于流式细胞仪的大多数抗体反应。免疫组化的主要缺点是它不能显示小淋巴细胞的表面免疫球蛋白，因此不能显示除了如浆细胞和免疫母细胞肿瘤等胞质丰富的肿瘤细胞外的大多数淋巴瘤中B细胞群的克隆性。

免疫组化也无法区分表面与胞质抗原。例如，胞质CD3存在于早期T细胞阶段（胸腺细胞）而表面CD3则见于成熟的T细胞阶段（外周T细胞）。当一肿瘤用免疫组化染色呈CD3阳性时，不能确定肿瘤细胞的发育阶段。NK细胞（胞质CD3阳性）和NK样T细胞（表面CD3阳性）之间的区别，同样也是如此。

此外，用免疫组化不能在相同细胞上作多重染色，也不能精确定量抗原以用于治疗监测。即使配以成像技术，也只能得到半定量结果。

最后，免疫组化的安排通常是在HE染色的切片检查完之后，因此得出结论起码要等到标本收到之后的第三天。

由于免疫组化的这些缺陷，常常需要使用流式细胞仪（FC）。用流式细胞仪，多个样本可以同时在含10个或10个以上单克隆抗体的面板上迅速处理。在一个良好的FC实验室，周转时间在3小时以内。当标本足够时，流式细胞仪为每个抗原的检查计数3000～5000个细胞。大量细胞的检查提高了FC的灵敏度和准确性，并使检测到少量的肿瘤细胞成为可能。FC能够在相同的肿瘤细胞上染多种抗原，而且可以区分表面与胞质的染色。6色流式细胞仪的使用，进一步增强了对肿瘤细胞的特征描述功能。流式细胞仪所获得的各个细胞群的百分比具有高度重现性，因此不同的实验室之间有可比性。

流式细胞术主要的缺点是缺乏与标记相关的形态学。换句话说，出现的标记可能代表正常的细胞，也有可能是肿瘤细胞。因此，对肿瘤细胞群的识别,有赖于FC中的门控技术从正常细胞中分离出肿瘤细胞。然后肿瘤细胞可以用一组单克隆抗体进一步鉴定。

用于免疫表型分析的单克隆抗体

自20世纪80年代初以来，已经开发出了上千个白细胞分化抗原特异性的单克隆抗体。这些抗体分为不同的功能组，而且与相同表位反应的抗体指定为相同的分化群（CD）。2004年12月在澳大利亚阿德莱德举行的第八届国际人类白细胞分化抗原专题讨论会上，最后一个分化群名称是CD339。这些抗体主要用于新鲜和适当冰冻的细胞，而且可用于流式细胞分析（表4）。不过，越来越多新开发的抗体，能与固定好的石蜡包埋组织中的抗原反应，它们可用于免疫组化检查（表5）。

根据与它们反应的抗原的不同，单克隆抗体可以分为六种。

1. 系列相关抗原：其中最常见的B细胞相关抗原包括CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD38、CD79、CD138和PCA-1；常见T细胞相关抗原包括CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、T细胞受体αβ和T细胞受体γδ；NK细胞相关抗原有CD16、CD56和CD57；粒单细胞抗原有CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD33、CD64、CD68和CD117。

2. 不成熟细胞抗原：这一类包括CD10、CD34、CD117和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。

3. 活化抗原：这一类由CD25、CD26、CD30、CD38、CD54、CD71和HLA-DR组成。

4. 组织相容性抗原：组织相容性抗原在指导细胞与细胞之间的相互作用中是十分重要的。例如，CD4细胞与携带HLA-Ⅱ类抗原的细胞反应，而CD8细胞与那些带HLA–Ⅰ类抗原的细胞反应。HLA-Ⅱ类抗原包括HLA–DP、HLA–DR和HLA–DQ。

5. 黏附分子：此类包括CD11a-CD18（淋巴细胞功能相关抗原1型）、CD44、CD56（神经细胞黏附分子）、CD54（细胞间黏附分子1型）、CD102（细胞间黏附分子2型）、CD106（VCAM-1）和CD31（血小板内皮细胞黏附分子1型）。

6. 增殖相关抗原：了解最多的增殖相关抗原包括Ki-67和PCNA。前者常用于免疫组织化学染色以评价肿瘤细胞的增殖活性。

表4常见单克隆抗体的细胞特异性和临床应用

分化抗原

单克隆抗体

细胞特异性

临床应用

CD1a

Leu6,OKT6,T6

胸腺细胞,朗格汉斯细胞

T-ALL,T淋巴瘤,组织细胞增多病

CD2

Leu5,OKT11,T11

E玫瑰花结受体

T-ALL,T淋巴瘤

CD3

Leu4,OKT3,T3

T细胞受体复合物

T-ALL,T淋巴瘤

CD4

Leu3,OKT4,T4

辅助性/诱导性T细胞

T细胞亚群的鉴定

CD5

Leu1,OKT1,T1

T细胞,B细胞亚群

T-ALL,T/B淋巴瘤,CLL

CD7

Leu9,OKT16,3A1

T-细胞，IgM-Fc受体

T-ALL,T淋巴瘤

CD8

OKT8,T8t

细胞毒性/抑制性T细胞

T细胞亚群的鉴定

CD10

CALLA,OKBcALLa,J5

不成熟B细胞和T细胞

ALL,B淋巴瘤

CD11b

Leu15,OKM1,Mo1

单核细胞,粒细胞,NK细胞,抑制性T细胞

AML

CD11c

LeuM5,αS-HCL3

单核细胞,HCL的B细胞

AML，HCL

CD13

LeuM7,OKM13,My7

单核细胞,粒细胞

AML

CD14

LeuM3,OKM14,MY4,Mo2

单核细胞,粒细胞

AML

CD15

LeuM1,My1

单核细胞,粒细胞,Reed–Sternberg细胞

霍奇金淋巴瘤

CD16

Leu11

NK细胞,粒细胞,巨噬细胞

NK细胞疾病

CD19

Leu12,OKpanB,B4

B细胞

B-ALL,B淋巴瘤,CLL

CD20

Leu16,B1

B细胞

B-ALL,B淋巴瘤,CLL

CD21

CR2,OKB7,B2

滤泡树突状细胞,B细胞,C3d

B淋巴瘤

CD22

Leu14,OKB22,B3,αS-HCL1

B细胞

B淋巴瘤,HCL

CD23

B6,Leu20

B细胞

B淋巴瘤,CLL

CD25

IL-2,OKT26a,Tac

T细胞上的IL-2受体(Tac抗原)

HCL,成人T细胞白血病

CD30

Ki-1,BerH2

Reed–Sternberg细胞,活化T或B细胞

霍奇金淋巴瘤,间变性大细胞淋巴瘤

CD33

LeuM9,My9

单核细胞,粒细胞

AML

CD34

HPCA-1,My10

造血祖细胞

急性白血病

CD38

Leu17,OKT10,T10

浆细胞,活化T或B细胞

骨髓瘤

CD41

J15

血小板GPIIb-IIIa

原始巨核细胞白血病

CD42a,b

HPL14,AN51,10P42

血小板GPIX和GPIb

原始巨核细胞白血病

CD43

MT-1,Leu22,L60

T细胞,B细胞亚群

T或B细胞淋巴瘤

CD45

HLE-a,LCA

所有白细胞

淋巴瘤,白血病

CD45RA

MT-2

T细胞,B细胞亚群

滤泡淋巴瘤

CD45RO

UCHL1

T细胞,B细胞,单核细胞,粒细胞

T淋巴瘤

CD56

Leu19,NKH-1

NK细胞

NK细胞疾病

CD57

Leu7,HNK-1

NK细胞,T细胞亚群

NK细胞疾病

CD61

10P61,VI-PL2

血小板GPIIIa

原始巨核细胞白血病

CD64

FcγP1,gp75

单核细胞

单核细胞疾病

CD68

KP1

单核细胞,组织细胞

单核/组织细胞肿瘤

CD71

Tf受体,OKT9,T9

活化T/B细胞,巨噬细胞

急性白血病,淋巴瘤

CD74

LN2

B细胞,单核细胞

B淋巴瘤

CDw75

LN1

B细胞,T细胞亚群

B淋巴瘤

CD79a

HM47,HM56,JAB117

B细胞

B淋巴瘤

CD79b

SN8,B29/123,CH3-1

B细胞

B淋巴瘤

CD103

HML-1,B-ly7

B细胞

HCL

CD117

C-kit,干细胞因子受体

造血干细胞

AML

CD123

IL-3受体

肥大细胞/嗜碱性粒细胞,DC2细胞,B细胞亚群

肥大细胞病,HCL,浆细胞样树突状细胞肿瘤

CD138

B-B4,1D4,F59-2E9,M115

FMC-7

HLA-DR

PCA-1

血型糖蛋白A

TCR-1,βF-1,WT31

TCR-δ1,TCS1,antiδ

B细胞,浆细胞

B细胞

B细胞,活化T细胞,原始粒细胞,原始单核细胞

浆细胞,单核细胞,粒细胞

红系细胞

T细胞

T细胞

B淋巴瘤,骨髓瘤

PLL,HCL,B淋巴瘤

B细胞肿瘤

骨髓瘤

红白血病

T淋巴瘤/白血病

T淋巴瘤/白血病

ALL,急性淋巴细胞白血病;AML,急性髓细胞白血病;CLL,慢性淋巴细胞白血病;HCL,多毛细胞白血病;IL-2,白细胞介素2;NK,自然杀伤;PLL,幼淋巴细胞白血病;Tf,转铁蛋白

由于使用者不能直接看到流式细胞分析仪检测的细胞，故制定了一套标准把血液肿瘤与正常白细胞区分开。

1．  免疫球蛋白轻链限制：表面免疫球蛋白轻链的比例是最常用的诊断标准，因为它同时定义了B细胞谱系以及克隆性。当一种轻链较其他轻链明显占优势时，就称为轻链限制，它表示了单克隆性。淋系肿瘤常常伴随单克隆性。

2．  B细胞群中表面免疫球蛋白丢失：正常B细胞同时表达B细胞抗原和表面免疫球蛋白。在某些淋巴肿瘤，如原发性纵隔B细胞淋巴瘤和前体B细胞肿瘤中，检测不到表面免疫球蛋白。

3．  同一细胞群中两种不同的细胞系标记共存：双细胞系标记已成为一些淋巴肿瘤的标志。最常见的例子是慢性淋巴细胞白血病，小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤，同时染B细胞标记（CD19或CD20）和T细胞标记（CD5）。

4．  大量细胞表达不成熟细胞标记：对于淋系肿瘤，不成熟的细胞标记包括末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、CD10和CD34。而髓系肿瘤，则经常表达CD34和CD117。

5．  细胞系抗原选择性丢失一个或多个：这一标准在诊断T细胞淋巴瘤中特别有用，因为T细胞没有类似于B细胞轻链限制的克隆标记。大多数实验室使用三个泛T细胞标记（CD3、CD5、CD7）进行比较。

6．  用TCR-Vβ抗体测定T细胞克隆性：一套TCR-Vβ抗体可以用来识别T细胞的克隆性。如果大多数的T细胞表达同一家族抗原，就表示可能是一个单克隆T细胞群。

Table5 免疫组化常用单克隆抗体

CD/抗原

细胞特异性

临床应用

ALK

ALCL细胞

ALCL

bcl-2

B细胞

B淋巴瘤

bcl-6

B细胞

B淋巴瘤

CD1a

胸腺细胞,朗格汉斯细胞

前体T细胞淋巴瘤/白血病

CD3

T细胞

T淋巴瘤/白血病

CD4

辅助性T细胞

T淋巴瘤/白血病

CD5

T细胞

T淋巴瘤/白血病

CD8

抑制性T细胞

T淋巴瘤/白血病

CD10

不成熟B细胞

ALL,滤泡淋巴瘤

CD15

Reed–Sternberg和髓细胞

霍奇金淋巴瘤

CD20

B细胞

B淋巴瘤

CD21

滤泡树突状细胞(FDC)

FDC肿瘤和滤泡的鉴定

CD23

B细胞,FDC

B淋巴瘤

CD30

Reed–Sternberg和活化T/B细胞

霍奇金淋巴瘤

CD34

造血干细胞

急性淋巴/髓系白血病

CD42b

血小板/巨核细胞

急性原始巨核细胞白血病

CD43

T细胞,B细胞亚群

T/B细胞淋巴瘤,髓系肉瘤

CD45

所有白细胞

淋巴瘤,白血病

CD45RA

T细胞,B细胞亚群

T/B细胞淋巴瘤

CD45RO

T细胞,B细胞亚群

T/B细胞淋巴瘤

CD56

NK细胞

NK/T细胞淋巴瘤/白血病

CD57

NK细胞

NK/T细胞淋巴瘤/白血病

CD61

血小板/巨核细胞

急性原始巨核细胞白血病

CD68

单核/巨噬细胞

单核/巨噬细胞肿瘤

CD79a

B细胞

B淋巴瘤

CD79b

B细胞

B淋巴瘤

CD117

造血干细胞

急性髓细胞白血病

细胞周期蛋白D1

B细胞

套细胞淋巴瘤

DBA-44

B细胞

多毛细胞白血病

Ki-67

增殖分数

高度恶性淋巴瘤

PAX/BSAP

B细胞

霍奇金和非霍奇金淋巴瘤

TdT

前体T/B细胞

前体T/B细胞淋巴瘤/白血病

TRAcp

淋系细胞

多毛细胞白血病

ALCL,间变性大细胞淋巴瘤；TdT,末端脱氧核苷酸转移酶；TRAcp,抗酒石酸酸性磷酸酶