中枢神经系统（CNS）感染性疾病是由各种病原微生物侵犯脑实质、血管及被膜引起的神经系统重症疾病，具有高病死率和致残率等特点。因病原微生物检测手段有限，极易延误诊断及治疗。宏基因组下一代测序（mNGS）基于大规模并行测序原理，利用多个DNA小片段平行测序来确定序列，可同时检测样本中全部病原微生物，对于CNS感染性疾病病原学诊断与鉴别诊断具有重要意义。本文综述近几年mNGS应用于CNS感染性疾病病原学诊断的相关文献，比较其在应用中的利弊，帮助临床医生提高对mNGS技术和其在诊断中枢神经系统感染性疾病中应用的认识。
中枢神经系统感染性疾病是神经系统重症疾病，早期诊断、及时治疗对改善患者预后至关重要。目前临床常用脑脊液病原学检测方法主要有：涂片镜检、病原菌培养、抗原抗体检测及分子生物学检测。涂片法虽然操作简便，但敏感性低；培养法是病原学诊断金标准，但耗时较长，不利于早期诊断；抗原抗体检测及分子生物学检测是目前临床中应用较广泛检测方法，但其诊断敏感度也仅能达到40%-50%。病原学诊断困难是制约CNS感染性疾病早期诊治主要障碍。
宏基因组下一代测序（mNGS）是一种DNA测序技术，基于大规模并行测序原理，在不需要靶基因前提下对样本中全部核酸进行提取、测序，并进行成像及数据分析。随着基因测序技术发展，mNGS已广泛应用于全基因组测序、基因组多样性研究、宏基因组学、表观遗传学、非编码RNA和蛋白质结合位点研究以及RNA测序基因表达谱分析。由于mNGS是无针对性对样本中全部基因组进行测序，检测样本中全部病原微生物，与传统脑脊液诊断技术相比，不仅具有高敏感度优势，更具有无偏性特点，这对CNS感染性疾病诊断与鉴别诊断十分重要。
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mNGS检测原理
基因测序技术最早由Sanger和Coulson于1975年首次提出并研发，被称为第一代测序技术。其基本原理是在所需核酸序列任一侧应用寡核苷酸引物，添加DNA聚合酶和核苷酸“构建块”混合物，使延长的核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，生成一系列不同拷贝“链终止”产物，然后在凝胶或毛细管系统上通过电泳分离出来并进行检测。宏基因组下一代测序是基于大规模并行测序原理，可同时对成千上万DNA片段进行测序。主要包括：①文库制备：将DNA分成多个短片段，并在这些小片段两端添加上不同接头，构建单链DNA文库；②应用不同方法进行DNA片段分离并扩增，形成不同DNA簇；③测序及分析。目前临床中常用的二代测序平台为illumina（旧称Solexa）和454方法（也称为RocheFLX），虽然不同测序技术使用方法不同，但基本原理相似。与一代测序相比，具有高效低成本优势，使得测序技术能够在临床中广泛应用。
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NGS在脑脊液病原诊断中的应用现状
2.1 CNS病毒感染：病毒性脑炎是临床中常见的CNS感染性疾病，可通过脑脊液病毒抗体检测、PCR检测进行病原学诊断。因病原体多样性，传统脑脊液检测方法敏感性有限。mNGS在CNS病毒感染诊断中已取得了一定进展，文献报道对常见病原菌检测有效，如单纯疱疹病毒1型、2型、3型（HSV-1、hsv-2、HSV-3）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、巨细胞病毒（CMV）、柯萨奇A9病毒等。mNGS可在不使用任何引物或探针情况下对样本全部核酸进行扩增和测序，其优势不仅体现在常规病毒检测，更体现在罕见病毒的检测。Julianne等人通过对病因不明脑炎病例进行脑脊液病原学NGS检测研究中，发现2例人细小病毒4（PARV4）病例；1例人类冠状病毒OC-43病例；1例人星状病毒MLB1病例及1例腮腺炎疫苗病毒感染病例。尽管对于此类病毒致病性仍有争议，但此检测方法无疑为脑脊液病原学诊断带来了新的可能。
除脑脊液病原学检测，mNGS技术在诊断病毒学方面还有许多潜在应用，如发现和鉴定未知病毒、超灵敏监测抗病毒药物耐药性、研究病毒多样性、进化和传播等。2020年新型冠状病毒横扫全球，尽管目前新冠病毒侵犯中枢神经系统病例罕有报导，但也为我们敲响警钟，病毒相关性疾病千变万化，及时诊断对于疾病治疗及遏制传播至关重要。随着测序技术发展，mNGS将成为应对新发疾病有效手段。
2.2 CNS细菌感染：细菌感染亦是CNS常见感染类型，病情多凶险，致死致残率高。迄今为止，已有数百种病原微生物被证实可引起此类疾病。由于检测手段有限，且抗感染药物滥用，传统细菌培养阳性率较低，尤其对未知病原体或混合感染识别较差。快速准确病原菌鉴定，并给予针对病原菌精准抗感染治疗是困扰临床工作的重大问题。mNGS检测可获得样品全部基因组信息，并可通过16srRNA基因分析进行细菌种类鉴定和分类学研究，有效检测和鉴定常见及罕见病原菌。同时mNGS有助于验证常规方法检测结果，检测是否存在合并感染及感染类型，尤其是在接受高级预防性抗生素治疗的患者中。在一项诊断小儿CNS细菌感染研究中指出，mNGS具有较高敏感性，使病原菌检出阳性率提高13.1%（病原菌检出阳性率由55.6%提高到68.7%）。在尚晶等人研究中发现，脑脊液mNGS病原学检出率为53.33%，与传统细菌培养相比，差异具有统计学意义。同时在Aicui等人研究结果表明，脑脊液细菌种类复杂，61.5%标本呈混合病原感染，mNGS对于混合感染病原菌鉴定有绝对优势。综上所述，mNGS不仅可提高CNS细菌感染诊断率，同时对混合感染鉴别及指导下一步治疗，均有重要意义。
2.3 CNS结核感染：目前，结核病在全世界范围仍广泛流行，CNS结核感染严重危害着人类健康。由于结核菌特殊性，常规病原学检测方法敏感度有限，且耗时长，早期诊断困难，进而延误治疗使预后不佳。近年来更多证据表明，mNGS检测CNS结核，其总敏感性为66.7%-84.4%，特异性为96.4%-100%。与其他脑脊液结核分枝杆菌相关检测相比，mNGS具有较高检出率。尽管mNGS对脑脊液结核分枝杆菌检测敏感度高，但仍存在一定局限性，首先其阴性预测值（NPV）仅为46.5%，未达到排除临床诊断标准；其次对结核分枝杆菌耐药性检测，不如传统分子生物学方法（如Xpert等）成熟；此外，由于成本较高，且对检测人员技术及实验室要求较高，目前在中低发达地区开展困难，因此限制了其在CNS结核病诊断中的应用。
2.4 CNS真菌感染：CNS真菌感染常见于免疫缺陷患者，近年来健康成人感染报道亦逐渐增多。CNS真菌感染类型最常见的为新型隐球菌。王芳等人对7例新型隐球菌脑膜炎患者，进行相关检查，其中隐球菌荚膜抗原检测阳性5例（71.4%），墨汁染色阳性3例（42.9%），培养阳性2例（28.6%），mNGS阳性3例（42.9%），mNGS敏感性与墨汁染色相近。而葛瑛等人对6例新型隐球菌脑膜炎患者进行脑脊液检测，5例患者mNGS阳性。从目前研究中可以发现，mNGS对于真菌检测敏感度与传统检测方法无明显差异，可能是由于样本量较小所致。但mNGS可以检测样本中全部病原微生物，能够在早期对脑脊液样本中真菌类型进行鉴别，对于临床精准治疗，提高疗效有非常重要的意义。
2.5 罕见感染鉴定：对于常见CNS感染性疾病，常规病原学检测手段虽然阳性率较低，但仍可通过患者临床表现及实验室辅助检查进行综合判断分析，经验性诊断治疗。而对于布鲁杆菌病、螺旋体、寄生虫等感染病例，仅能在专科医院进行检查鉴别，常会导致误诊及延误治疗。多项研究表明，mNGS对于布鲁氏杆菌感染、囊虫感染具有较高检出率。同时，对于临床中罕见病原感染，mNGS更具优势。辛子凯及程杨等人报道，应用mNGS技术诊断CNS李斯特菌感染，赵伟丽及Wang等人报道了应用mNGS技术诊断CNS伪狂犬病毒感染，其他还有CNS Powassan病毒感染、猪链球菌感染、广州管线原虫感染、诺卡菌感染、曼陀罗拉木裂体感染等报道。由此可见，mNGS是CNS少见病原菌感染性疾病的诊断有效检测手段。
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脑脊液mNGS检测技术优势
①广泛识别已知和少见病原体，甚至发现新的生物体；②发现和鉴定新病毒，监测抗病毒药物耐药性，并通过基因测序研究病毒多样性、进化和传播等；③同时进行多种病原菌检测，是混合感染和CNS感染鉴别诊断有效手段；④脑脊液作为无菌体液，污染可能性较其他样本低，因此mNGS检测更具有临床诊断意义。
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现阶段面临问题
4.1 mNGS检测假阴性问题：李霞等人研究指出，mNGS假阴性原因主要有：①采样环节，如病原载量过低等；②储存或运输过程，如未严格-20℃低温冻存致核酸降解；③实验环节，如真菌破壁效率较低，影响真菌检出率；④数据库不完善，如新发病原体未包含在数据库中；⑤mNGS方法学原理不完善，如人源序列比例过高等。而在Qian等人研究中指出，预先使用抗生素也可造成mNGS检测结果假阴性。由此可见，多个环节均可影响mNGS检测结果。因此，临床医生应根据实际情况，严格把握取材时间及总量，并严格规范操作流程，尽量减少假阴性发生。
4.2 假阳性结果：假阳性结果可误导或干扰临床诊断，mNGS检测临床标本中的微生物可以反映正常微生物群、瞬时定植菌、样品污染或感染。脑脊液虽然是常见无菌样本，但仍不能排除污染可能，因此还需要进一步研究，以寻求区分定植和感染最佳方法。
4.3 新微生物鉴定：对于新微生物检测，mNGS具有强大诊断效能。然而，在临床样本中发现一种新病原体或一组不寻常微生物只表明其潜在致病作用，并不能确定其与疾病因果关系。因此，对于检测结果中新微生物或罕见微生物，是否为此次感染致病微生物，仍需根据此病实际情况，进行综合分析。
4.4 目前已有研究致力于解决mNGS人源DNA污染排除问题，如该问题能够得到彻底解决，病原学检测准确率会跨越式发展。
4.5 mNGS检测可能会漏掉不存在或短暂存在于脑脊液中的病原菌（如伯士疏螺旋体、神经梅毒）。因此对于mNGS阴性结果且仍对诊断存在疑问病例，建议联合血液学mNGS检测，进行综合诊断。
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小结
随着测序技术发展，mNGS技术已趋于成熟，对于脑脊液病原体检测率明显提高，但其敏感度仍不足以满足临床诊断需要。现阶段可以通过改进样本处理、提取、扩增和测序方法，来提高mNGS病原菌检测敏感度。首先，开发新标本处理方法，改进病原菌富集和捕获方式，尤其对于胞内寄生菌，有效破壁方案是提取病原菌重要步骤。其次，高效提取核酸进行扩增，尽可能排除人源性核酸及其他定植菌污染，也是提高敏感度重要方法。最后，需不断完善DNA文库，提供广泛覆盖范围，提高数据分析能力，进一步提高检测敏感度。mNGS技术目前已开始广泛应用于CNS感染检测，随着该技术的不断改进，将促进CNS感染病原学诊断，为疾病诊治提供理论依据，更好地为临床服务。
吉林医学 2021年9月第42卷第9期
作者：赵雪瑶 李大伟（北华大学附属医院）
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