林奇综合征(LS)是遗传性结直肠癌(CRC)的常见形式,是由DNA错配修复(MMR)基因的种系突变引起。早期识别LS患者非常重要,研究表明,对LS患者和MMR突变携带者的定期结肠镜检有效降低了65%的死亡率。
目前对于LS的诊断依赖于MMR基因的种系分析,但是如何为个体选择有效的MMR基因种系检测以提高筛查效率至关重要。目前国际上LS临床筛查策略主要依据NCCN、ESMO或CSCO推荐的分子检测标准,但这在中国人群中的可行性和有效性一直缺乏大规模数据评估。
中国人群LS筛查数据
中国医学科学院肿瘤医院病理科应建明教授、邹霜梅教授、董林博士团队[1]的研究,总共纳入4195名符合条件的CRC患者,是迄今中国最大的LS回顾性研究。研究显示中国CRC中dMMR占比8.7%,LS占比2.7%。
研究方法
在病理诊断阶段,对CRC患者常规进行MMR蛋白和BRAF V600E的免疫组化(IHC)分析。MLH1缺乏的BRAF野生型患者进行MLH1启动子甲基化分析,接下来进行有针对性的二代测序和MLPA检测,具体如下图。
应建明教授、邹霜梅教授、董林博士团队研究流程图
在分析这个筛查策略之前,先来了解下CRC的分子特征。
CRC的分子特征
CRC是由于细胞内多种遗传和表观遗传畸变逐步累积导致的,从腺瘤到癌的发展由三个主要途径引起[2]:
染色体不稳定(CIN)途径: 具有致癌基因(如KRAS)激活和抑癌基因(如APC,SMAD4和TP53)失活的常规腺瘤-癌途径,发生在约85%的CRC中。
微卫星不稳定(MSI)途径: 发生在约15%的散发性CRC和90%以上的LS中,其中散发性CRC MSI表型几乎完全与 MLH1启动子甲基化有关。
CpG岛甲基化(CIMP)途径: 具有CpG岛甲基化表型的锯齿状途径,引起约35%的CRC。如果在MLH1启动子中发生甲基化,则导致MSI-H癌症,如果在肿瘤抑制基因中发生甲基化,则导致MSS癌症。
驱动CRC发生和发展的遗传和表观遗传分子途径[3]
LS的分子诊断
1
MMR与MSI
MMR蛋白IHC检测、MSI检测或两者同时检测均可以作为LS的初筛,IHC和MSI检测各有优缺点。
IHC主要优点是能够特异性地鉴定可能存在缺陷的MMR蛋白以及易得性,然而,IHC的判读具有较大主观性。并且对于某些已治疗的CRC和约10%MMR蛋白功能缺陷的CRC患者,IHC结果可能造成误判。基于PCR的MSI检测则需要足够的肿瘤组织,但是检测结果客观准确。
Leticia Moreira等人[4]的研究表明,1395例pMMR CRC患者中有12例(0.9%)存在LS相关的致病性种系突变。提示不采用补充的MSI试验,将会漏检一小部分LS患者,所以有条件的单位,应推荐两种检测方法同时进行,互为验证,提高检测的敏感性。并且对所有新诊断的CRC病例进行无偏见的MMR和MSI检测可能会成为识别所有LS病例的最有效方法。
2
MLH1甲基化与BRAF突变
MSI-H的CRC可能是散发性或遗传性的,大多数MSI-H CRC由MLH1启动子甲基化导致散发性CRC,IHC显示MLH1和PMS2丢失。散发性MSI-H的CRC经常伴有BRAF V600E突变,这在LS相关CRC中极为罕见。
所以,对于MSI-H或IHC检测MLH1和PMS2缺失时,BRAF突变和MLH1启动子甲基化检测可作为排除LS的标准。在应建明教授团队的研究中显示,中国MLH1缺乏的CRC患者中BRAF V600E突变占比15%,这一数据明显低于以往的报道,文章解释可能与入组人群性别相关。结合MLH1启动子甲基化检测,可将MMR基因种系分析的转诊率降低31.9%。
值得注意的是:研究显示[5]约1%的LS同时伴有BRAF突变。同样有体细胞MLH1启动子甲基化的LS患者的相关报道,在应建明教授团队的研究中也显示了3.7%的MLH1启动子甲基化的LS个体。强调了对于有LS家族史的个体,BRAF V600E突变和MLH1启动子甲基化均不能排除LS的可能性。
另外,Tomer Adar等人[6]的研究中显示:MLH1蛋白缺失时,BRAFV600E和MLH1甲基化总体一致性为81%,BRAF突变预测MLH1启动子甲基化的阳性预测值和阴性预测值分别为98.9%和41%。
3
NGS与MLPA
MMR基因种系突变是诊断LS的标准,应建明教授团队[1]的研究显示LS患者中82.6%存在点突变或小的基因组改变,可用NGS技术检测,17.4%存在大片段重排(Large genomic rearrangements ,LGRs),需要借助MLPA技术检测。
另外,对于具有MSI-H或IHC显示MMR蛋白缺失(排除MLH1甲基化),但是胚系检测未见MMR基因致病突变的病例诊断为“Lynch样综合征”,约占临床怀疑Lynch综合征的60~70%。文献中对于lynch样综合征有许多不同解释[7],可能由于目前技术尚未能检测出MMR基因的某些胚系突变,例如在内含子序列或启动子序列的突变;其次还有的认为除了MMR胚系突变外还存在其他机制,同样导致MMR基因失活。这部分病例多存在体细胞MMR双等位基因突变。
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