改良碳青霉烯灭活试验(Modified Carbapenem Inactivation Method, mCIM)检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶
一. 何时检测?基于流行病学或感控目的。备注:即使mCIM结果呈阳性,亦无需修改碳青霉烯类药敏试验结果。目前不推荐mCIM试验用于常规检测。
二. 方法:美罗培南灭活试验
三. 试剂和材料
1. TSB (2 ml)
2. 美罗培南纸片(10ug)
3. 1-ul和10-ul接种环
4. 营养肉汤(如MH肉汤、TSB肉汤)或MHA平板(100mm或150mm)
5. 美罗培南敏感质控株-大肠埃希菌(ATCC25922)
四. 步骤
1. 取1ul接种环的过夜培养纯菌落于2ml TSB肉汤中
2. 震荡混匀10-15秒
3. 每管放入一张含10ug美罗培南的无菌纸片,确认纸片浸没于菌悬液中
4. 35℃±2℃大气环境孵育4小时±15分钟
5. 孵育结束时,立即用营养肉汤或生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希ATCC 25922菌悬液(直接菌悬法)
6. 菌悬液制备和平板涂布必须15分钟内完成,干燥3-10分钟
7. 用10ul接种环将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出,将纸片贴于试管内壁,轻轻按压以挤去纸片上多余水分,然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上。100mm的MHA平板最多贴4张纸片,150mm的MHA平板最多贴8张纸片(图1)。
8. 倒置平板,35℃±2℃大气环境孵育18-24小时
9. 量取抑菌圈直径
图1. 10ul接种环取出美罗培南纸片(a);将纸片贴于试管内壁并挤去多余水分(b);同一接种环取出纸片(c)并贴于MHA平板上(d)
五. 结果解释:见图2a和2b
1. 碳青霉烯酶阳性:美罗培南抑菌圈直径为6-15mm 或直径为16-18mm但抑菌圈内有散在菌落。若待测株产生碳青霉烯酶,纸片中的美罗培南被该酶降解,结果为无抑菌圈或抑制大肠埃希菌ATCC 25922的活性降低。
2. 碳青霉烯酶阴性:抑菌圈直径≥19mm。若待测菌株不产碳青霉烯酶,纸片中的美罗培南不被水解,仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长。
3. 中性:抑菌圈直径为16-18mm,无法判断是否存在碳青霉烯酶(见备注)
图2a. 阴性对照BAA1706(A)和阳性对照BAA1705(B)
图2b. 碳青霉烯酶产生株。备注:mCIM结果阳性
六. 备注:
1. 中性结果
a) 检查待测菌株和大肠埃希菌ATCC 25922的纯度
b) 检查美罗培南的质控结果
c) 重复mCIM试验
d) 如果结果仍为中性,建议检测碳青霉烯酶基因
2. 某些菌株可能出现美罗培南抑菌圈内出现散在菌落,若抑菌圈直径≤18mm,结果判定为阳性;若抑菌圈直径≥19mm,结果判定为中性结果。
3. CLSI目前只推荐该标准方法用于肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测
七. 报告:
1. 阳性:报告“检测到碳青霉烯酶”
2. 阴性:报告“未检测到碳青霉烯酶”
3. 中性:报告“无法判断是否产碳青霉烯酶,联系实验室进行讨论”
八. 附加试验和报告
1. 报告mCIM结果用于感染控制或要求提供流行病学相关信息
2. 即使mCIM结果呈阳性,亦无需修改碳青霉烯类药物敏感性试验结果
九. 质控:
1. 每天测试阳性和阴性质控对照株
2. 碳青霉烯酶阳性株:肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705
3. 碳青霉烯酶阴性株:肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706
4. 美罗培南纸片的质控按CLSI要求执行
5.
5. 资料来源:CLSI M100S-27th
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