慢病毒包装与感染

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每一个学生物的yin，都有一对隐形的翅膀，尤其是做慢病毒di，上辈子一定是美少女战士！当然，你也可以是夜礼服假面啦~

有历史照片为证（毫无PS痕迹！）

辣么，什么是慢病毒呢？

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慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从而保证其高效表达并且对细胞不产生随机整合可能产生的伤害。

    慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。

   慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物（Mix）和一个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，以慢病毒载体pLV为例，如下图（图片来自Addgene）

pLV载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件WPRE，psi等。

不同系统包装质粒混合物也不一样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，比例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋白的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。

    以下介绍用293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。

准备

试剂篇

? 核心质粒；

? 指数生长的293T细胞；

? 病毒包装质粒Mix:1 μg/μl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所用的包装病毒质粒也不一样，此系统可用于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
? 转染试剂：turbofect， 也可以用其它的如lipo2000等。

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细胞分盘

通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基平铺细胞于35mm 培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80％以上）。将细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前 2h 换液（用1.5ml 完全培养基置换旧的培养基）。

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混匀核心质粒和包装质粒

取无菌1.5ml EP管，加入400μl 无血清DMEM，加入1.5μg 核心质粒和1.5μg 病毒包装质粒，及6μl turbofect (turbofect ：质粒＝2:1），充分混匀，静置15-20min。

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孵育

将这400μl 的混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO₂的37℃温箱孵育。

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收集病毒上清

6-10 h后吸去培养基，加入2.5ml37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，40h左右可以收集含慢病毒的上清进行感染或者分装后置于－80℃储存待用。（1500rpm离心五分钟，一般可收集到2ml 含病毒上清）

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病毒感染

1）将细胞平铺于6孔板或12孔板，最佳密度为30%－70％。

2）对于六孔板：（12孔板减半）

 Infectmouse cells：800-1600μl virus + 1600-800 μl fresh medium =2.4 ml total

 Infecthuman cells：200-800μl virus + 1200 μl-800 μl fresh medium =2 ml total

3）加入2-5μg/ml polybrene, 充分摇匀后置于37℃温箱孵育。

4）12-24h 后换液，长满后传代或者检测表达，做实验。

如此包装，你听明白了吗？

讲这么久，都饿了吧~

慢病毒包装及感染细胞

from莫非

一位，不愿透露姓名的女神来稿

编者按

如果看文字步骤不懂怎么操作的话，可以下载JoVE小视频参考操作哦~~链接Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles