近日，以色列Weizmann Institute of Science的Itay Tirosh教授与美国Broad Institute的Mario L. Suvà教授在Molecular Cell杂志上发表观点文章Single-Cell RNA Sequencing in Cancer: Lessons Learned and Emerging Challenges，探讨了单细胞测序技术尤其是RNA测序在肿瘤中的应用，和其所面对的挑战。
对病人肿瘤切片标本的大量基因组和表达谱分析构成了我们对于癌症的大部分理解。然而，肿瘤并不是单一构成而是由多种细胞组成的错综复杂的“生态系统”，包括肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞等等，肿瘤的精确表征被大量的基因组学分析方法所掩盖。日前，单细胞基因组技术已经成为解析人类肿瘤中不同种类细胞的有效工具，为破译癌症生物学中遇到的问题提供了令人信服的方法。因此，以下将对癌症中单细胞RNA测序的研究主题、遇到的机遇与挑战以及新兴的单细胞基因组学方法进行讨论，为癌症生物学的研究提供新方法与新思路。
癌症是一种遗传性疾病，恶性肿瘤的发生与内在因素和外在因素引起的基因异常表达息息相关。对癌症患者的生物样本分析彻底改变了我们对于癌症的理解。基因表达谱的分析主要是由大量的数据与分析所主导，生物样本的表达谱被描绘为单一均质的实体，然后把表达谱的平均量作为该样品的表达谱。但是肿瘤内表达异质性（Expression intra-tumor heterogeneity，eITH）控制着肿瘤发展的许多关键方面，肿瘤细胞的驱动比如肿瘤生长、转移与抗性的产生都受到肿瘤异质性的影响。恶性肿瘤的细胞异质性主要由三个因素决定：（1）遗传异质性，由于肿瘤发育和进化过程中出现的突变，驱动多种细胞程序发生；（2）表观遗传与发育程序，例如在肿瘤干细胞在分化过程使得癌症细胞具有可塑性；（3）细胞外的因素以及空间决定因子对于肿瘤细胞的氧气供应、营养条件以及细胞-细胞之间的相互作用的影响。单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术可以直接测量肿瘤样品中细胞的转录输出，并且测量的数据代表的是细胞将其遗传、表观遗传和环境线索的整合，从而为科学家们提供线索确定癌细胞的适应性、行为和对治疗的反应。因此，scRNA-seq研究将细胞生物学置于癌症生物学的中心，并为大量基因组研究提供不同的分辨率和视角。
细胞类型、细胞状态、恶性肿瘤和非恶性肿瘤细胞
对肿瘤中表达多样性的分析通常分为两个层面：一类是不同细胞种类，比如恶性肿瘤细胞、T细胞或者是成纤维细胞；另外一种则是不同细胞状态，比如在相同的细胞周期、在相同的代谢状态或者其他的可以作为聚类依据的细胞动态过程。随后可以根据优先表达的基因作为注解细胞类型或者状态的依据，比如大规模拷贝数改变（Copy number alterations, CNV），点突变和融合蛋白。最近scRNA-seq领域一个新兴的研究主题是科学家们发现恶性肿瘤细胞表达谱的不同与肿瘤的来源更相关，而非恶性肿瘤细胞表达谱的聚类则主要是依据细胞种类而不依赖于样本的来源【1-6】。这表明：（1））恶性肿瘤的细胞间异质性通常大于任何特定类型的非恶性细胞；（2）对于恶性肿瘤细胞间异质性远大于肿瘤内异质性。这些结果表现出相当程度的肿瘤间异质性，并且可能被误解为反映癌细胞的肿瘤内异质性作用有限。单细胞方法给了我们进一步解析恶性肿瘤内部异质性的模式的利器，而这些异质性模式用先前的细胞生物学方法是难以评估以及分离分析。
癌细胞中复发异质性模式
在个体中观察到的异质性模式是什么样的？首先，单个基因在细胞与细胞之间的表达水平都是不同的，一部分是因为基因表达的随机性，另一部分是因为表达调控存在一些“噪音”。然而除了这种随机性之外，基因组表达在细胞之间具有连贯性的变化，反映了具有不同生物学功能细胞的不同状态。例如数十个细胞周期相关基因的表达说明某些细胞进入细胞周期而其他细胞在被分析的时刻并不在细胞周期之中【3,4】。类似地，如果与缺氧或者应激反应相关的许多基因上调这说明某些细胞正在通过这样的反应来响应他们对微环境中营养元素或者氧气缺乏的情况【2-4】。这两个过程——细胞周期与细胞应激反应——反映了肿瘤细胞内的异质性的常见模式，这些模式在不同的患者和不同的癌症类型中可以观察到。
除了那些“通用”的异质性模式之外，还存在特定的环境依赖模式，可能对给肿瘤定型提供更多信息。多项先前的研究发现，除了细胞周期和胁迫压力存在之外，在特定癌症类型的多个患者中发现了特定的肿瘤内表达程序（即，在同一肿瘤中的恶性细胞中一致地变化的基因组），而这些表达程序并不存在于其他癌症类型（图1）。最近，通过33种黑素瘤样品的scRNA-seq分析鉴定了黑素瘤中促进免疫逃避和对免疫检查点抑制剂具有抗性的癌细胞状态【6】。在头颈癌中，恶性细胞的上皮分化程序表达和上皮—间充质转换程序的表达不同，对转移有重要意义【5】。这些程序强调了假定的分化等级结构，与类干细胞的自我更新和浸润性增加相关。
图1 恶性肿瘤细胞中异质性模式
这些初步结果表明了两个重要结论。首先，恶性肿瘤的异质性模式对于肿瘤的维持和进展具有相当大的意义，需要进一步探索针对特定肿瘤亚群的分析方法。其次，这些模式在相同癌症类型或亚型的患者中的一致性表明这些模式反映了癌症起源相关的细胞基本特性。这些模式反映了癌细胞的“表观遗传图景（Epigenetic landscape）”：每种类型的癌症细胞只能使用特定的程序。因此，细胞可动态激活那些“可接近的”程序，导致它们在个体肿瘤内的可变性。该模型表明，每种肿瘤或肿瘤亚型的程序可变性以及其对肿瘤细胞特性方面影响非常重要。
整合大量单细胞肿瘤表达谱
这些初步研究为肿瘤的单细胞表达谱的实用性提供了概念性的证明。然而，意识到这种方法的局限性也很重要。首先，scRNA-seq仅提供细胞的部分取样，高表达的基因相对于中等或者偏低表达的基因来说偏差较大。其次，scRNA-seq对样品质量要求很高，因此不适用于保存处理不佳的临床标本的分析。第三，高成本限制了对大量肿瘤样本进行分析的能力，一般来说在每项研究中通常仅对少数样本进行分析。鉴于单细胞方法和已经存在的综合数据库如癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas , TCGA），预计单细胞数据库并不会完全取代大量肿瘤分析数据，而是会与现有和新的数据进行批量整合以促进我们对肿瘤生物学的理解。
在过去，批量分析肿瘤细胞测序数据的时候忽略了这样一个事实，由于每个剖面上的不同种群的存在对肿瘤微环境信号的分析会有误。因此，许多最近的方法和研究都集中在通过对其体积分布的去卷积来推断肿瘤的组成【7】。此类方法通常需要对肿瘤细胞类型进行定义，而现在可以直接且准确地从scRNA-seq研究中获得。在接下来的几年中，预计这一趋势将会扩大并且根据其测量或推断成分对剖面进行批量分析将成为标准。一般来说，可以研究通过单细胞方法在肿瘤内鉴定的任何细胞亚群的预估丰度与批量样品的相关性，从而部分地规避大小有限的单细胞群组。
单细胞癌症分析中的新挑战和方向
在接下来的几年中，利用scRNA-seq研究肿瘤的方法将进一步整合到癌症研究中，并将用于解决更多肿瘤生物学问题（图2）。以下将简要介绍一些可能解决的主要问题，并指出scRNA-seq领域的新兴技术将有助于这些研究。
图2 利用scRNA-seq亟待解决的癌症生物学中的问题
区分遗传与非遗传机制的贡献：单细胞多组学分析
遗传异质性是肿瘤之内以及肿瘤之间产生多样性的重要来源。但是越来越多的证据开始指向那些非遗传学的机制之上。因此，区分相同的细胞中细胞状态与遗传状态才能够很好地区分这些机制。迄今为止，大多数的scRNA-seq的研究要不然是完全忽略了癌症细胞的遗传状态，要不然就只是评估了部分细胞的遗传状态。随着近年技术的发展【8】，已能够同时将细胞状态与遗传状态相结合，为未来的肿瘤生物学提供更加综合的观点。目前，正在开发多组学的方法以将mRNA水平与各种其他特征相结合，例如蛋白质水平、DNA甲基化、染色质可及性以及克隆扩增等等。这些方法提供新的方法论将肿瘤异质性的产生以及scRNA-seq推进到更高的水平。
细胞-细胞相互作用和空间位置：具有空间分辨的单细胞技术
每个肿瘤类似于生态系统，因此，每个细胞的状态可能高度依赖于其精确的空间位置和与相邻细胞的相互作用。这些复杂的相互作用及其对癌细胞生物学的影响仍然知之甚少。将转录组与空间信息偶联将显着提高预测和进一步表征此类相互作用的能力，因此，正在开发许多方法以将scRNA-seq与空间信息耦联。用于肿瘤分析的空间分辨技术的不断改进以及来自不同技术的数据的整合，将在未来几年内显著推进这些方向，并提高我们对细胞-细胞相互作用以及空间效应的理解。肿瘤微环境的复杂性意味着这种潜在相互作用的数量很大，需要进行后续研究以确定个体相互作用的重要性。
残留肿瘤与肿瘤复发：冷冻样品分析
在许多癌症类型中，治疗反应通常伴随着肿瘤的侵袭性增加以及抗药性肿瘤的复发，突出了研究残余肿瘤进展和生长对于复发性肿瘤出现的重要性。前人的研究比较了原发性和复发性肿瘤的不同点并揭示了耐药性的各种遗传原因【9】。未来的研究将扩展这种方法并通过scRNA-seq进行比较，提供复发性肿瘤的更详细视图及其与相应原发性肿瘤之间的差异。一个很大的挑战是目前的scRNA-seq需要的新鲜肿瘤样本，在已经给定复发时间的情况下同时处理匹配的原发与复发性肿瘤样本困难极大。然而，目前已有多种方法可以实现冷冻样品的分析，从而能够对不同的样品集合进行对比。
肿瘤亚群：检测、功能与起源
肿瘤进展是一个进化过程，少数细胞足以通过选择逐渐出现新的表型。因此，关键亚群如癌症干细胞、耐药细胞和构成转移的迁移细胞可能反映了一种非常罕见的亚群（例如小于0.1％的细胞亚群），这种亚群逃脱了大多数方法的检测，包括目前的scRNA-seq方法。未来的技术可能会帮助发现独特的亚群。一旦发现了独特的亚群，即需要进一步确认其功能和临床意义。主要由两种方法可以进一步分析这些亚群。首先，大批量的研究将揭示亚群的存在频率与临床特征之间统计相关性。第二种方法将依赖于scRNA-seq对这些亚群的详细表征，以鉴定出能够分离这些亚群的标记物以及在动物模型或者细胞中进一步进行功能研究。但需要提出的一个警告是已建立的肿瘤的scRNA-seq无法识别突变首次发生“突变细胞”， “突变细胞”可能与产生肿瘤的细胞不同。恶性肿瘤细胞和正常细胞之间的比较不仅突出了相似性，还提供了肿瘤细胞与其假定的起源细胞之间的差异，从而增加了我们对致癌过程的理解。
独特的肿瘤表型：队列N = 1的单细胞分析
虽然治疗决策是基于大群体中的统计，但异常的肿瘤表型也非常常见且更加难以解决。在过去，这些病例的独特表型很难理解因为大多数的表型主要通过大量遗传分析进行研究。然而，scRNA-seq以及上述相关的技术改使得能够以前所未有的深度和广度来表征肿瘤生态系统。鉴定独特的肿瘤表型是非常重要的工作，因此队列N=1的scRNA-seq对此研究会很有意义。由于极端表型通常是后期检测到的，因此这种方法也可以用于对已存档的冷冻样本的分析。
结束语
长期以来，肿瘤异质性使癌症生物学家和临床医生感到困惑。由于缺乏准确测量肿瘤中单个细胞的基因组工具，科学家们倾向于依赖肿瘤细胞群体的平均测量结果或者是单个细胞标记实验，因而掩盖了肿瘤异质性的许多关键方面并阻碍了我们对肿瘤生物学的理解。测量转录输出作为细胞类型和遗传学功能方面的标记，为重新理解癌症起始和进化奠定了基础。虽然对肿瘤异质性的了解最初可能看起来令人生畏，但是新的肿瘤细胞状态的细胞过程正在被大规模的研究，将会有更多的肿瘤细胞发生过程中的漏洞可用于探讨癌症的治疗方案。人类癌症单细胞基因组学是一个时代的开始，为更多的发现铺平了道路，同时为更广泛的临床应用提供了大数据的参考。
制版人：珂
参考文献
1. Ferreri, A. J., Illerhaus, G., Zucca, E., Cavalli, F. & International Extranodal Lymphoma Study, G. Flows and flaws in primary central nervous system lymphoma. Nature reviews. Clinical oncology 7, doi:10 1038/nrclinonc 2010 1039-c1031; author reply doi:1010:1038/nrclinonc 2010 1039-c1032, doi:10.1038/nrclinonc.2010.9-c1 (2010).
2. Patel, A. P. et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344, 1396-1401, doi:10.1126/science.1254257 (2014).
3. Tirosh, I. et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science 352, 189-196, doi:10.1126/science.aad0501 (2016).
4. Tirosh, I. et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature 539, 309-313, doi:10.1038/nature20123 (2016).
5. Puram, S. V. et al. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer. Cell 171, 1611-1624 e1624, doi:10.1016/j.cell.2017.10.044 (2017).
6. Jerby-Arnon, L. et al. A Cancer Cell Program Promotes T Cell Exclusion and Resistance to Checkpoint Blockade. Cell 175, 984-997 e924, doi:10.1016/j.cell.2018.09.006 (2018).
7. Aran, D., Hu, Z. & Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome biology 18, 220, doi:10.1186/s13059-017-1349-1 (2017).
8. Macaulay, I. C. et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.Nature methods12, 519-522, doi:10.1038/nmeth.3370 (2015).
9. Kim, C. et al. Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing. Cell173, 879-893 e813, doi:10.1016/j.cell.2018.03.041 (2018).
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