近年来，研究发现人类的氨基酸代谢会随着一天中的时间而变化。膳食蛋白质摄入量对骨骼肌的生长和维持很重要。它们不仅是身体蛋白质的来源，而且还能激活骨骼肌的合成。特别是，已知支链氨基酸，即亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸 (BCAA)。例如，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，可通过哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)途径激活骨骼肌合成，并且对肌肉生长很重要。据报道，早餐和午餐补充蛋白质会增加老年人的骨骼肌体积。然而，消化吸收能力和代谢过程表现出昼夜变化。目前，之前一直没有研究阐明蛋白质的摄入量分布及其生物利用率和/或阈值的昼夜变化是否会影响肌肉生长。
今年7月6日，日本早稻田大学、日本大学和长崎大学的研究人员在在《Cell Reports》杂志上发表了标题为“Distribution of dietary protein intake in daily meals influences skeletal muscle hypertrophy via the muscle clock”的研究论文，研究人员通过研究一天中不同时间摄入蛋白质对小鼠骨骼肌的影响，发现全天蛋白质摄入量的分布会影响骨骼肌的大小，而早餐中的高蛋白质摄入量会促进骨骼肌肥大。同时，支链氨基酸在促进骨骼肌肥大的过程中发挥了重要的作用。
摄入蛋白质的时间会导致骨骼肌差异
实验小鼠用3%的异氟醚麻醉。单侧手术切除腓肠肌和比目鱼肌远端肌腱可导致足底肌肉功能性超负荷。闭合对侧小腿的切口，而不手术消融远端肌腱，可以使得足底肌起到假肌肉的作用。
为了检查蛋白质摄入分布的影响，研究人员在每天早晚两次给ICR小鼠（美国癌症研究所分送各国饲养的实验小鼠）喂食2.0克餐（图1A上）。在三种蛋白质分布模式（早餐高蛋白、早晚蛋白平均分布和晚餐高蛋白）中，小鼠每天平均喂食11.5%或8.5%的蛋白质食物（图1A下）。研究人员发现，ICR小鼠能够在4小时内吃掉2.0克的食物。在超负荷肌肉组中，三种分布模式喂食组的初始和最终体重和生长率都没有显着变化，所有模式喂食的小鼠跖肌重量都因超负荷而增加，与晚餐高蛋白小鼠相比，早餐高蛋白小鼠的肌肉重量对超负荷的反应更高（图1B和1C）。在假肌肉组中，三种模式喂食都没有导致肌肉重量改变（图1B）。在超负荷肌肉组中，与晚餐摄入11.5%蛋白质的小鼠相比，早餐喂食8.5%蛋白质的小鼠肌肉肥大程度增加17%，尽管前者的每日总蛋白质摄入量低于后者（图1C）。
早餐时摄入BCAA会加速骨骼肌增大
研究人员发现，早餐补充BCAA会诱导骨骼肌肥大，晚餐补充则没有明显的效果（图1D和1E）。然而，补充含有BCAA以外其他氨基酸的酪蛋白后，没有观察到骨骼肌肥大的时间依赖性效应（图1F和1G）。这表明，BCAA的摄入参与了超负荷诱导骨骼肌肥大的时间依赖效应。不过，体重、运动活动模式和总活动水平并不受支链氨基酸或其他氨基酸的摄入时间的影响。
膳食蛋白质的时间依赖性效应需要肌肉时钟
为了探讨蛋白质摄入分布与生物节律之间的关系，研究人员检查了全身ClockΔ19基因突变和MKO（Bmal1基因敲除）小鼠。补充说明，Clock是昼夜节律核心基因，而Bmal1基因是大脑和肌肉arnt-like蛋白1，作为一种转录因子与Clock形成异源二聚体以共同激活昼夜节律基因表达，许多研究表明BMAL1的破坏会导致昼夜节律异常。
高蛋白早餐增加了野生型(WT)小鼠超负荷诱导的肌肉肥大，但对ClockΔ19小鼠没有影响(图2A和2B)，在WT小鼠中观察到运动活动的昼夜变化，而在ClockΔ19小鼠中观察不到(图2D和2E)。对ClockΔ19小鼠的研究结果表明，生物钟的遗传不活跃和生物节律的紊乱可能会影响蛋白质摄入对肌肉生长的时间依赖性效。研究人员进一步通过组织特异性的基因敲除来检测小鼠时钟基因和运动活性之间的联系。在Bmal1flox/flox小鼠中观察到高蛋白早餐对肌肉肥大的促进作用，而在MKO小鼠中则未观察到(图2F和2G)。这表明，昼夜节律参与了肌肉生长。
膳食蛋白质摄入分布对小鼠BCAA水平和基因表达昼夜变化的影响
为了检验早餐和晚餐蛋白质摄入对血液和肌肉氨基酸水平的影响，测定了小鼠血浆和骨骼肌中游离氨基酸的昼夜变化(图3A-3F；图S4)。高蛋白膳食后，血浆BCAA水平升高，高蛋白膳食时间并不影响血浆BCAA水平的升高(图3A-3C)。在假肌肉和超负荷的肌肉组中，BCAA对高蛋白餐的时间依赖性反应不存在(图3D-3F)。除甘氨酸、组氨酸和丝氨酸外，大多数游离氨基酸在超负荷肌肉中没有表现出时间依赖性的反应(图S4B)。在晚餐时喂食高蛋白餐的超负荷小鼠中，特定时间点的肌肉游离甘氨酸和组氨酸水平较高(图S4B)。早餐喂食高蛋白餐的小鼠肌肉负荷过重(图S4B)。Snat2(中性氨基酸转运体)的表达不受蛋白质摄入分布的影响。
接下来，研究人员检测了早餐(B蛋白组)或晚餐(D蛋白组)喂食高蛋白餐的小鼠血浆胰岛素样生长因子1(IGF-1)和肌肉IgF1水平的昼夜变化。血浆IGF-1水平无昼夜变化，两组间无明显差异，B蛋白组肌肉IgF1表达随负荷增加而增加，且在授时间因子ZT 21（Zeitgeber time [ZT]，是由实验室所订的环境时间，在节律研究中人为控制光照）处高于D蛋白组(图3g)。虽然B蛋白组超负荷的肌肉合成增加，但用mTOR和S6激酶(S6K)磷酸化来评价的蛋白质合成并没有什么改变(图4A、4D和4E)。此外，研究人员还检测了肌肉萎缩相关基因的昼夜变化(图3H-3I)。这些基因的表达和昼夜变化不受蛋白质摄食分布的影响，但在两组超负荷的肌肉中，Atrogin1和Mst1的表达分别增加和减少。
研究人员还检测了生肌基因表达的昼夜变化。pax3、Pax7、Myod和myf6的表达水平没有因假肌肉和超负荷肌肉组的蛋白质摄入分布而改变(图3L)。与IgF1的表达相似，肌源性因子5（Myf5）和人肌细胞生成素（Myog）的表达也因负担过重而增加。B蛋白组的昼夜变化在ZT21高于其他时间点（图3J和3K）。MYF5在早餐或晚餐吃高蛋白餐的老鼠超负荷的肌肉中，蛋白质水平显示出与其基因表达水平相似的趋势。另外，从WT和Bmal1flox/flox小鼠超负荷肌肉中观察到了MYF5蛋白水平的时间变化趋势，而在ClockΔ19突变和MKO小鼠中没有发现MYF5蛋白水平的变化趋势。这表明，IgF1和生肌基因的昼夜表达节律影响了摄入蛋白质的分布。
最后，为了评估时钟基因的表达，研究人员测定了早餐或晚餐时喂食高蛋白餐的小鼠骨骼肌中几个时钟基因的表达水平(图3M-3O；图S3I-S3M)。在假肌肉和超负荷肌肉两个组中，PER2和Bmal1表达呈规律性变化(图3M和3N)。Cry1在假肌肉组的表达呈现典型的节律模式，而在超负荷的肌肉中表达不明显(图S3K)。蛋白质摄入分布对Reverbα、Clock和Per1的表达也有影响。在早餐和晚餐分别喂食高蛋白餐的小鼠的超负荷肌肉中，观察到Reverbα和Clock的节律性表达。在进食高蛋白晚餐的假肌肉和超负荷肌肉小鼠中，观察到Per1在非活动期的高水平表达。因此，不同蛋白质摄入时间部分影响了肌肉时钟基因(如Reverbα、Clock和Per1)的表达，而Per2、Bmal1、Cry1/2、Rorα和血清皮质酮水平的昼夜变化不受蛋白质摄入量分布的影响(图3M-3O)。
膳食蛋白质分布对自噬的影响及其在超负荷诱导骨骼肌肥大中的作用
研究人员测试了自噬对早餐和晚餐蛋白质摄入的反应。在活动期的四个时间点(每餐前后)的Western blotting分析显示，B蛋白组超负荷的肌肉中，晚餐后LC3B-II蛋白水平维持在较高水平(图4A和图4F)，补充说明，LC3是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。为了研究自噬激活在超负荷诱导的骨骼肌肥大中的作用，研究人员在限时蛋白喂养的小鼠中测试了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)的作用。每日腹腔注射3-MA可减轻B蛋白组超负荷所致的肌肉肥大，但不能减轻D蛋白组的肌肉肥大(图4G-4I)。3-MA对肌肉重量的减轻仅见于超负荷肌肉组，而不见于假肌肉组(图4H)。此外，在WT和Bmal1Flox/Flox小鼠中，LC3B-II水平在ZT0(餐后)有升高的趋势，而在ClockΔ19和MKO小鼠中未观察到这种趋势。因此，可以认为早餐摄入高蛋白，晚餐摄入低蛋白可能通过激活自噬来增强超负荷诱导的骨骼肌肥大。
人体蛋白质分布与肌肉功能的关系
该招募了60名老年女性，根据饮食调查结果得出早餐和晚餐蛋白质摄入量的平衡情况，并将其分为两组。B蛋白组的参与者习惯性地在早餐时摄入比晚餐时更多的蛋白质(图5B和5D)。在D蛋白组则相反。每日蛋白质总摄入量在两组之间没有显著差异(图5C和5E)。在这项研究中参与者的蛋白质摄入量高于日本推荐的老年妇女膳食摄入量。此外，他们每天的蛋白质摄入量也满足了先前研究中报道的维持和增加肌肉质量所必需的1.0-1.2g/kg体重/天的要求。结果表明，B蛋白组的肌肉质量往往高于D蛋白组(图5F)。B蛋白组的骨骼肌指数(SMI)和握力显著高于D蛋白组(图5G和5H)。此外，SMI与早餐蛋白质摄入量占总蛋白质摄入量的百分比呈显著正相关(图5I)。
结语
该研究表明，第一，在每日投食两次对小鼠模型中发现，小鼠在早上摄入更多对蛋白质，以一种依赖于局部肌肉生物钟的方式促进了超负荷诱导的肌肉生理肥大。其次，在早餐中添加BCAA，使得小鼠表现出骨骼肌肥大。再者，BCAA的分布依赖效应与生物节律有关，最后，对于老年女性来说，早餐摄入高蛋白饮食的女性的SMI和握力更高，总之，表明一天之际在于晨。
原文链接：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00712-9
