导读 核糖体小亚基(英文:Ribosomal Small
Subunit,简称“SSU”)是核糖体中较小的核糖体亚基。每个核糖体都由一个核糖体小亚基与一个核糖体大亚基共同构成。小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因,如细菌中的16S和真核生物的18S,是微生物的分子“身份证”,常用于微生物多样性和分类等研究。传统方法难以避免扩增引物偏倚性影响结果,而对SSU
rRNA进行全长测序可以消除这种局限性,更准确的鉴定微生物。1990年,有研究报导能够从复杂环境样品中获得的一些16S rRNA序列,打开了研究地球上未知微生物世界的大门。近年来,SSU rRNA 的测序常常用于微生物的研究。SILVA数据库中约有近200万条的全长SSU序列。大多数全长的SSU序列都是通过PCR扩增,测序拼接获得的,成本高。二代测序的得到的序列短,虽然三代测序序列长,但测序错误率高,通量低,价格贵。测序技术的缺陷、缺少好的通用引物等限制了研究者发现、认识新的物种。 本研究基于SSU共有的poly(A)合成cDNA,构建文库进行测序,分析7种环境样本的微生物群落构成。 本研究基于SSU共有的poly(A)合成cDNA,构建文库进行测序,分析7种环境样本的微生物群落构成。 原名:Retrieval
of a million high-quality, full-length microbial 16S and 18S rRNA gene
sequences without primer bias 译名:基于16S和18S rRNA基因的全长无偏差测序研究微生物多样性 期刊:Nature
biotechnology IF:41.667 发表时间:2018年 通讯作者:Mads Albertsen 作者单位:奥尔堡大学
1 测序方法的建立
1.1 DNA样品准备
提取样品中RNA,采用凝胶电泳法选择目标片段。基于核酸poly(A)合成单链cDNA。依据模板合成双链cDNA。
图1 cDNA合成过程
1.2 构建文库测序
双链DNA片段进行扩增,采用凝胶电泳法进行纯化,纯化后片段再次扩增,用于建立测序文库(Read-tag library)与建立接头文库(Linked-taglibrary)。拼接测序片段, PCR扩增,高通量测序获取SSU序列,利用inner引物扩增接头文库进行测序。
图2 构建文库测序
将具有相同接头文库的序列归为一类,分为一类的基因序列进行拼接,获得SSU的全长序列,进行物质注释。
图3 数据分析
图4 生命树覆盖率
图5 古细菌覆盖率
本研究通过多步骤优化得到小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)全长cDNA,采用高通量方法获得高质量、无引物偏倚的SSU rRNA全长序列。建立方法分析不同环境中的微生物群落构成。结果显示,该方法的错误率低,结果信息量大,发现约50%的新物种。通过与SILVA数据库进行比对,发现了大约有58%的OTU与SILVA差异度大于97% ,可见环境中还有大量的新物种未被人们发现。
本研究依据核糖体的全长对不同环境中的样品进行研究,该方法能够有效扩充现有数据库,完善微生物的分类,促进人类对地球上未知微生物的认识。
本文由李红霞编译,李红霞、江舜尧编辑。
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