RPAD出手！将环状RNA一网打尽！

   作者：小又

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环状RNA自2013年发现以来，已成为非编码RNA研究领域的热点之一。环状RNA与疾病的关系密切，在多种实体瘤和血液肿瘤中均有环状RNA的研究。然而需要承认的是，对环状RNA，我们的研究还处于初步阶段，主要是由于测序方法和技术的限制，很多环状RNA还尚待鉴定。

那么如果想开展环状RNA的研究，如何选择最佳的方法鉴定到某一体系中最全的环状RNA呢？该用什么方法获得更高纯度的环状RNA？如何使环状RNA的测序信号不被丰度更高的线性RNA掩盖？

你要的答案，都在这里啦！

近日，美国国家卫生研究所（NIH）的KotbAbdelmohsenand和Myriam Gorospe在国际期刊Nucleic Acids Research上发表研究成果《High-purity circular RNA isolation method (RPAD) reveals vast collection of introniccircRNAs》。

他们建立了高纯度提取环状RNA的新方法——RPAD，采用该方法分析发现许多由外显子组成的环状RNA，即使拥有一样的接合位点（junction site），他们的大小和序列却是不同的，并且，与以往研究不同的是，大量内含子序列形成的环状RNA被鉴定，改变了传统的认为环状RNA大多来源于外显子的观点。

下面，我们来详细解读该方法。

研究者建立的新方法——RPAD，全称是“RNase R treatment followed by Polyadenylation and poly (A) + RNADepletion (RPAD)”，实验流程见下图。由于环状RNA没有末端，所以可以抵抗核酸外切酶RNase R的剪切作用，而大部分线性的RNA，包括mRNA，rRNA以及miRNA都会被RNase R剪切而降解。

遗憾的是，RNase R并不能完全将线性的RNA去除，这就给进一步分析环状RNA带来了干扰，于是研究者给剩下的线性RNA加上poly(A)的尾巴，利用偶联了Oligo(dT)的柱子纯化不含poly(A)尾的环状RNA。

该方法可以大大提高环状RNA的纯度，减少线性RNA的污染（下图）。只经RNase R处理，线性RNA（黑色柱子）含量仍较高，而经RPAD处理后，线性RNA（橘色柱子）残留较低。

利用该方法，研究者鉴定了一批新的RNA，并发现环状RNA也存在可变剪接的现象，即结合位点序列一致，但环状RNA的大小和序列不完全相同（下图）。

总的来说，该研究建立的新方法以及鉴定到的新的环状RNA均有重要意义，也为更全面的研究环状RNA的产生和功能奠定了基础。想开展环状RNA研究的学者们不妨尝试RPAD的处理方法，可以获得更多的环状RNA信息。

值得注意的是，现在研究的环状RNA大多来源于外显子，而通过PRAD的方法，可以鉴定到很多来源于内含子的环状RNA，而这类来源于内含子的环状RNA的功能还是未知的，值得探索。

参考文献：Panda AC, De S, Grammatikakis I, Munk R, Yang X, Piao Y, Dudekula DB, Abdelmohsen K, Gorospe M. (2017) High-purity circular RNA isolation method (RPAD) reveals vast collection of introniccircRNAs. Nucleic Acids Res [Epub ahead of print]