注意：该使用指南为简易版，在实际使用时请查阅正式英文说明书。
1. 产品概述
产品描述
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)为即用型、2×浓度的反应混和液，该产品包含了基于SYBR Green I检测模式的qPCR和两步法qRT-PCR进行实时DNA检测时所需的所有试剂(除了引物与模板)。该试剂内含参比染料ROX，适用于所有需要ROX校正的实时荧光定量PCR平台。
储存条件及其稳定性
该产品在-15~-25°C条件下可稳定存放至标签上的有效期之前。若存放于+2~+8°C条件下，则可短期储存（不超过1个月）。
注意：请将该产品避光保存。
请避免将该产品反复冻融。
该反应液添加引物与模板后可在+15~+25°C及避光条件下稳定储存24小时。
该产品用干冰运输。
2. 产品使用方法
2.1 实验前准备
实验最佳反应条件(包括DNA模板和PCR引物浓度、孵育温度和时间、循环次数)应根据特异性模板/引物而异。
样本准备
请使用纯度、浓度经优化摸索且不含PCR抑制物的DNA模板(如，基因组学或质粒DNA，cDNA)。为获得高重复性的核酸分离产物，请使用以下试剂：
- MagNA Pure LC或MagNA Pure Compact系统结合系统配套的核酸分离试剂盒用于核酸自动分离。
- 手动分离请使用High Pure Nucleic Acid Isolation Kit。
更多详细信息，请阅读罗氏应用科学部生化产品目录，或访问罗氏应用科学部主页
www.roche-applied-science.com. 请使用至多250 ng基因组DNA或50 ng cDNA。
请将DNA模板储存于PCR级别的水中或5 – 10 mM 的Tris/HCl(pH 7.5-8.0)中。由于EDTA与镁离子会形成敖合物，故请避免将模板溶解于TE缓冲液。
引物
PCR引物的最终浓度为0.1 – 0.4 μM。建议初次试验时每种引物的浓度为0.3 μM。
注意：实验中使用的引物对浓度相等。
PCR引物的设计决定了扩增子长度、熔解温度、扩增效率及产量。引物设计同时也取决于PCR程序的选择(两步法与三步法)。
引物设计可通过实时PCR系统供应商(如，PrimerExpress)提供的相关设计程序，或者您可以在网上获取相应的信息(如，Primer3:
http://frodo.wi.mit.edu/)。
如果您想在后续实验中用水解探针检测您的实验结果，请选择熔解温度(Tm)在+58~+60°C之间的引物。您也可以采用罗氏应用科学部通用探针库提供的预测试的探针来进行验证SYBR Green I检测。与通用探针库的探针相对应的PCR引物的设计，请参考在线ProbeFinder 软件
www.universalprobelibrary.com。
阴性对照
为了检测DNA污染物，在阴性对照组中将DNA模板替换成PCR级别的水。
反应体积
FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)适用于多种不同体积的反应体系，反应中使用的反应管/板及合适的反应液体积，请参考不同仪器供应商的建议。
内参染料ROX
原则上，实时PCR系统(除LightCycler系统外)提供了两种不同的检测方法：
结合内参染料(通常为ROX)的检测来校正各管SYBR Green I荧光信号。
单独检测SYBR Green I荧光信号。
检测方法的选择取决于所用仪器(如，是否具有检测内参染料荧光信号的通道)及仪器光源(卤素灯或激光)。
含ROX内参染料的FastStart Universal SYBR Green Master被证实无需调整其ROX的浓度即可用于ABI仪器(ABI PRISM 7000 测序系统、ABI 7300 实时PCR 系统、ABI 7500 实时PCR 系统、ABI 7700 测序系统以及ABI PRISM 7900 HT 快速实时PCR系统)，也可用于Stratagene Mx3000P QPCR 系统。
注意：如果您不使用实时PCR系统的参比通道或您的系统不配备参比通道，请选择FastStart SYBR Green Master (without ROX)。
如果您使用Bio-Rad iCycler iQ5 实时PCR检测系统，请选择Universal SYBR Green Master (without ROX)，并参考Bio-Rad iCycler iQ5 实时PCR检测系统指导手册进行External Well Factor Plate步骤以检测孔道因子。
2.2 实验步骤
PCR反应液的准备
以下操作为50 μl 反应体系，如使用其他体系请作相应修改。 步骤 操作
①
为了使试剂最大程度地保证实验结果，在打开之前先将其融解，并于微型离心机上轻微离心。
用移液枪吹打混匀溶液后冰上保存。
注意：如果您使用的是5-ml或50-ml瓶装的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)，请将小瓶上下翻转数次(请勿剧烈摇动)。
②
准备100×浓度的PCR引物溶液(30 μM)。
③
将反应管置于冰上， 在50-μl的单个PCR反应体系中，依次加入下表中的反
应液组分； 试剂 体积 最终浓度
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)
25.0 μl
1×
正向引物(30 μM)
0.5 μl
300 nM
反向引物(30 μM)
0.5 μl
300 nM
水，PCR等级
19.0 μl
总体积
45 μl
注意：如果需要准备多次反应PCR混合液，请将上述各组分体积按照z倍做准备(z=反应数+1)。
④
用移液枪将混合液小心混匀，请勿漩涡。
移取45 μl PCR混合液至PCR反应管或PCR 微板孔中(取决于您的实时PCR系统)。
⑤
加入5 μl DNA模板(不超过250 ng 基因组DNA或50 ng cDNA)。
注意：在初次试验中为了获得cDNA模板的最优模板量，将未经稀释，1: 10稀释，1: 100稀释的cDNA模板进行平行对照实验。
用移液枪小心混匀。
⑥
根据仪器的指导手册处理PCR管或PCR微板(如， 使用透光的PCR管盖或用自黏箔封闭PCR板)。
PCR
PCR扩增程序设计有很多种，两步法与三步法都能产生比较理想的实验结果。如采用两步法，选择长度较短的扩增子(约为150 bp)，且退火延长温度应为+60°C(如，典型的PCR反应为95°C变形15s，60°C条件下退火并延长1分钟，通常完成40个循环)。
为了得到最佳结果，请确认所使用的仪器已校准过，并将实时PCR循环仪中检测通道设置在SYBR Green 或 FAM(如，530nm)。
下表为标准PCR流程的例子：
注意：如果您使用配有FastPlate的ABI系统(如，ABI 7500 快速实时PCR系统或ABI PRISM 7900 HT 快速实时PCR 系统)进行20-μl反应体系的快速qPCR流程，请根据括号中的提示进行操作，循环时间可减至1小时。
①
请参考您的仪器供应商提供的操作手册，并根据以下参数进行操作： 循环数 分析模式 目标温度 持续时间 备注
1(可选)
无
+50°C
2分钟
如果反应液中加入了UNG酶以防止交叉污染
1
无
+95°C
10分钟
激活FastStart Taq DNA 聚合酶
4
无
+95°C
15秒(10秒*)
扩增与实时分析
定量
根据引物而定(典型为
60秒(30秒*)
+58~+60°C)
*为快速qPCR的持续时间。
②
将PCR管或PCR板放进仪器开始反应。
③
在反应结束后，根据仪器的定量与熔解曲线分析操作指南进行结果分析。
2.3 相关步骤
防止交叉污染
UNG酶可防止 PCR 过程中的交叉污染。此技术过程包括在扩增中加入脱氧尿苷三磷酸盐(dUTP)进行产物扩增，在以后的扩增反应中加入UNG并进行高温预处理。如果在后面的PCR反应液中出现含有dUTP的前次扩增污染物，UNG会将污染物降解，从而失去被再扩增的能力而无法成为PCR模板。由于目标DNA不含dUTP，因此不受UNG影响。
dUTP 是FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 中的成分。
注意：防止交叉污染的步骤需要用到LightCycler Uracil-DNA Glycosylase。每50-μl PCR 反应加入1.25 – 2.5 U。
两步法RT-PCR
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)也可用于两步法RT-PCR。在两步法RT-PCR中，RNA反转录成cDNA是不在实时PCR仪器上进行的独立于其它反应的步骤。利用cDNA 作为起始样本材料来进行后续的扩增及在线监测需根据实时PCR标准流程操作。我们建议您使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 进行RNA的反转录，cDNA 合成的具体操作请参考相关说明书。
3. 相关产品订货信息 产品名称 包装 目录号
FastStart SYBR Green Master
4×1.25 ml
10×5 ml
04 673 484 001
04 673 492 001
FastStart Universal Probe Master(ROX)
2×1.25 ml
10×1.25 ml
10×5 ml
1×50 ml
04 913 949 001
04 913 957 001
04 914 058 001
04 914 066 001
FastStart TaqMan® Probe Master
2×1.25 ml
10×1.25 ml
10×5 ml
04 673 409 001
04 673 417 001
04 673 433 001
FastStart TaqMan® Probe Master (ROX)
2.5 ml(2×1.25 ml)
12.5 ml(10×1.25 ml)
50 ml(10×5 ml)
04 673 450 001
04 673 468 001
04 673 476 001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
50 reactions, including 10 control reactions
100 reactions
200 reactions
04 379 012 001
04 896 866 001
04 897 030 001
LightCycler® Uracil-DNA Glycosylase
100 U
03 539 806 001
HighPure PCR Template
Kit for 100 purifications
11 796 828 001
Preparation Kit
Water， PCR-grade
25 ml(25 vials of 1 ml)
25 ml(1 vial of 25 ml)
100 ml(4 vials of 25ml)
03 315 932 001
03 315 959 001
03 315 943 001
详细内容请点击下载：Roche荧光定量试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)中文说明书
英文版FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)
FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)
Universal ready-to-use hot start reaction mix for qPCR and qRT-PCR on all real-time PCR systems requiring normalization with ROX.
For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Product No.
Pack Size
04913850001
4 x 1.25 ml for up to 500 reactions of 20 µl final reaction volume
04913914001
10 x 5 ml for up to 5,000 reactions of 20 µl final reaction volume
FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) includes a novel reference dye that enables its use on all real-time PCR instruments requiring normalization with ROX, without modifications or adjustments to the specific instrument or protocol. This ready-to-use, 2x concentrated master mix contains all reagents (except primers and template) needed for running quantitative, real-time DNA detection assays, including qPCR and two-step qRT-PCR, in the SYBR Green I detection format. FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) generates excellent results on instruments such as the Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR System or the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (see Figure 1). This product is not intended for use with LightCycler® Instruments.
Improve PCR sensitivity and specificity.
Minimize the formation of nonspecific amplification products.
Avoid over-estimation of qPCR results.
Eliminate nonspecific amplification products and primer-dimers that increase the amount of bound quantified SYBR Green I.
Amplify and detect a broad range of DNA or cDNA targets.
Amplify fragments up to 500 bp long, including those that are GC- or AT-rich.
Save time and effort in qPCR preparation.
Eliminate the need to mix components, titrate MgCl2, or perform other time-consuming optimization steps.
Prevent false positives resulting from carryover contamination.
Use this dUTP-containing mix with Uracil-DNA Glycosylase to eliminate contaminating DNA carried over from previous PCR reactions.
Contents
FastStart Universal SYBR Green Master (Rox), 2x concentrated master mix that contains FastStart Taq DNA Polymerase, Reaction Buffer, Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), SYBR Green I, and a reference dye.
原文链接：
http://www.bioku.net/archives/4878
