免疫荧光经验分享~

(1)直接法双重免疫荧光标记：

将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2)间接法双重免疫荧光标记：

用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

实验注意事项： 

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;

(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;

(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

最后来说一说免疫荧光的经验之谈！

1、合适的细胞密度

细胞密度是试验成功的第一步，细胞密度太大，会造成细胞过于拥挤而边界不清晰，不仅细胞形态不佳且易导致染色背景深。同理细胞过少时不仅容易贴壁不好观察时不好找细胞，而且由于细胞过少可能活性不佳从而易发生非特异性荧光染色。不管是用六孔板还是共聚焦皿细胞密度以达到75%-85%最佳。

2、细胞固定和通透

固定剂的选择依赖于抗原的亚细胞定位（膜蛋白，可溶，细胞骨架相关蛋白等）。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定剂，适用于绝大多数蛋白。如果是研究膜蛋白的话，最好用3.7%-4%的甲醛。而研究细胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步骤，通透即是在膜上打孔，让抗体更易进入细胞与抗原结合。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100，而选择甲醇固定一般无需再通透，甲醇本身就有通透的作用。

3、封闭条件的优化选择

为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前用封闭液封闭，这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清，一般来说，血清价格比较昂贵，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以说是万能的封闭血清。另外封闭时间不易过长，30-60min即可，且封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育即可。

4、一抗二抗的选择

封闭过后需要一抗孵育，可以选择4度过夜孵育或者室温3h，以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好，抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来，再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低，会造成信号太弱，如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标，一抗要来自不同种属，荧光二抗的光谱也要分开。

5、洗涤步骤

免疫荧光过程中，有很多洗涤步骤，用PBS即可。在洗涤过程中，一要注意动作轻柔，固定后的细胞比较脆弱，如果太过大力，很容易把细胞吹洗掉，二是洗涤时间要把握好，每次洗涤5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把细胞干着，不然容易造成背景着色。