暗中观察
一、双萤光素酶报告实验介绍
萤光素酶（Luciferase）指自然界中能够产生生物发光的酶，是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染内参为试验提供基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得实验结果更为可信。
双萤光素酶报告实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase，FLUC)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renilla luciferase，RLUC)为内参基因。双萤光素酶报告实验具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，已成为分析转录因子对启动子的调控作用、启动子结构、基因激活、miRNA靶基因的经典实验。
二、启动子双萤光素酶报告实验
（一）转录因子对启动子的调控作用分析
利用双萤光素酶报告实验分析转录因子对启动子的激活作用大多需要构建如图1所示的3种质粒，即具有强启动子：转录因子基因结构的转录因子过表达质粒，具有目的启动子：FLUC结构的报告质粒，具有目的启动子：RLUC结构的内参质粒（也可以将目的启动子：FLUC，强启动子：RLUC结构构建到一个质粒中）。目的启动子一般用目的基因转录起始位点上游约2 KB的序列。
图1 转录因子对启动子调控作用分析的质粒结构
将3种质粒转染到细胞中，检测FLUC和RLUC的活性，用转染过表达空载体的细胞作为对照。对照组中FLUC只有本底的表达水平，实验组转染了目的转录因子过表达质粒，目的转录因子大量表达，若目的转录因子能够作用于目的启动子，则FLUC的表达被激活，如图2（Hao et al.，2017）所示。
图2 转录因子MYB对CDO1的启动子的激活作用
很多研究会增加一组阴性对照，用FLUC上游没有目的启动子的报告质粒（如pGl-3-basic空载体）代替具有目标启动子的报告质粒，用来证明目的转录因子对目的启动子的作用是特异的，如图3（Zhang et al.，2017）所示。若果已知或者预测出目的转录因子的作用元件，可以将目的启动子中的该作用元件突变掉，用来证明目的转录因子确实通过该作用元件与目的启动子产生作用，如图3（Zhang et al.，2017）所示。
图3 转录因子TFAP2A对TGFβ的启动子的调控作用
分析转录因子对启动子抑制作用大多用靶向目的转录因子的siRNA或者shRNA表达质粒代替转录因子过表达质粒，转录因子的表达水平被敲低后，FLUC的相对表达水平升高。如图4（Pham et al.，2017）所示，在MCF7和HCC1937细胞中，抑制转录因子FOXC2的表达，分析其对p120-catenin的启动子的抑制作用。
分析转录因子对启动子的抑制作用也可以增加一组阴性对照，用FLUC上游没有目的启动子的报告质粒代替具有目的启动子的报告质粒，用来证明目的转录因子对目的启动子的作用是特异的。
图4 转录因子对启动子抑制作用分析
有些研究用siRNA或者shRNA表达质粒代替转录因子过表达质粒，研究转录激活作用。如图5（Liu，et al.，2017）所示， 在Eca109和Kyse150细胞中，用siRNA抑制转录因子c-Jun表达，分析其对c-MYC的启动子的激活作用。
图5 用siRNA或者shRNA表达质粒研究转录激活作用
有些研究用转录因子表达质粒研究转录抑制作用。如图6（Chen，et al.，2017）所示，共表达野生型DEAF1抑制由DEAF1的启动子驱动的荧光素酶表达，而共表达DEAF1的突变体p.G212S、p.W234R、p.R246T、p.K305del或者ADWA则没有抑制作用。
图6 过量表达转录因子研究转录抑制作用
利用双萤光素酶报告实验研究转录激活作用时，启动子的本底活性低（对照组萤光素酶的活性低），实验组过量表达转录因子，启动子的本底活性高，实验组抑制转录因子表达。
利用双萤光素酶报告实验研究抑制作用时，启动子的本底活性低，实验组抑制转录因子表达，启动子的本底活性高，实验组过量表达转录因子。
（二）启动子结构分析
将启动子序列（通常2 kb左右）进行分段截短，或者对特定位点进行突变，再分别构建入Luciferase报告载体，检测其启动子活性，分析启动子中的顺式作用元件的。
将一系列具有启动子截短片段的报告质粒和内参质粒转染到特定的细胞中，检测双萤光素酶的活性，可以分析启动子中顺式作用元件的位置。如图7（Zhao，et al.，2016）所示，分析ACSL1启动子中的顺式作用元件的位置，-1634/+21片段的活性与-1933/+21片段相比显著降低，-140/+21片段的活性与-325/+21片段相比也显著降低，表明ACSL1启动子的-1933/-163和-325/-140处具有顺式作用元件。
图7 启动子中顺式作用元件分析
将一系列具有启动子截短片段的报告质粒、过表内参质粒转染到目的转录因子过表或者抑制细胞中，检测双萤光素酶的活性，可以分析启动子中目的转录因子作用元件的位置。如图8（Ashkenazi，et al.，2016）所示，分别使用两种黑色素瘤细胞526mel和624mel，对CEACAM的启动子区域选择了600bp-200bp的截短片段，共转染过表达SOX9，这5个片段都能够被抑制，表明这5个片段中都有SOX9的作用元件。
图8 启动子中特定转录因子的作用元件分析
（三）基因激活分析
利用双萤光素酶报告实验进行基因激活分析，只需要共转染报告质粒和内参质粒，在不同实验条件下检测双萤光素酶的活性，也可以增加转染不含启动子的报告质粒的对照组，证明激活作用的特异性。如图9（Ma，et al.，2017）所示，在253J-BV细胞中，1,25D3能够诱导miR-101-3p表达。
图9 药物对基因的诱导作用
分析信号通路激活时，将信号通路的下游响应原件构建到报告质粒中，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。如图10（Breit et al.，2016）所示，cAMP response element（CRE）是cAMP信号通路的下游响应原件，D-glucose和fructose-1，6- bisphosphate均能够激活cAMP信号通路。
图10 cAMP信号通路激活分析
三、miRNA靶基因验证
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3´UTR起作用，需要将目的基因3´UTR序列或者靶序列构建至载体萤光素酶基因的下游（图11），通过比较过表达或者干扰miRNA后萤光素酶的活性变化，探究miRNA对目的基因的抑制作用。并且将靶序列突变，确定miRNA与靶基因的作用位点。
图11 3´UTR序列或靶序列的报告质粒结构
双萤光素酶报告实验可用于检测miRNA对mRNA和lncRNA的靶向作用，需要将miRNA过表达质粒或者miRNA模拟物、报告质粒和内参质粒（也可以将目的启动子：FLUC，强启动子：RLUC结构构建到一个质粒中）共转染细胞，检测双荧光素酶的活性，如图12（Andriani et al.，2018）和图13（Lu et al.，2017）所示。
图12 miR-16作用于HGF mRNA的3´UTR
图13 miR-150-5p作用于lncRNA linc00673
也可以通过抑制miRNA表达，检测miRNA对mRNA和lncRNA的靶向作用。
参考文献
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