干货！最新lncRNA&DNA甲基化的研究套路

        开始之前，我们还是先温习下基础概念。DNA胞嘧啶甲基化是一种重要的维持基因组完整性和调控基因表达的表观遗传修饰。lnc RNA可通过和染色体修饰或者重构因子作用调控基因的表达。lncRNA在发挥功能的时候可能是作为信号分子，也可能作为媒介招募其他的调控因子从而到靶基因上发挥调控基因表达的功能。因此，近几年就有文章报道lncRNA能够参与到基因组 DNA 特定基因的甲基化过程，并在其中发挥着重要作用。

       植物中DNA甲基化主要是通过RNA干扰导致基因转录沉默的过程完成该过程。比如：在植物中的转座子或者其他的DNA重复区域，由RNA聚合酶将单链RNA合成双链 RNA。多得到的双链RNA在植物中被降解成只有24bp的siRNA[1]。最后24bp与其他复合体组成一个稳定的复合体构成一个大的效应分子，引导植物中的从头合成甲基转移酶 DRM2 到染色体特定的区域催化新的甲基化的 DNA 的形成。

      哺乳动物中研究人员发现 lnc RNA 能够招募 DNA 甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a，Dnmt3b 到其靶基因的启动子上，从而在该 lnc RNA 对应的靶基因上完成甲基化功能。比如：研究人员在小鼠的骨骼肌干细胞向成肌细胞分化过程中发现一类 lnc RNA 能够招募甲基转移酶Dnmt1，Dnmt3a 和 Dnmt3b 到其靶基因上，导致靶基因的甲基化从而调控其靶基因的表达。因此推测lncRNA可能参与了介导DNA甲基化。

    下面将以2018年在Circulation杂志(IF=19.80)上发表的文章——主动脉瓣疾病中lncRNA和DNA甲基化的研究作为案例进行介绍[2]：

       已知主动脉瓣钙化是典型的主动脉瓣的非正常矿物质化疾病。主动脉瓣的钙化活性受到NOTCH1的控制，其调控关键钙化前基因RUNX2和BMP2的表达。lncRNA可通过改变基因表达模式而影响细胞。Fayez通过全基因组的甲基化谱和表达谱的分析挖掘在主动脉瓣钙化疾病中lncRNA和DNA甲基化互作模式，并进行功能分析探究lncRNA对主动脉瓣钙化的影响。研究路线为：

 

图1 筛选差异RNA

图2 细胞原位杂交确定H19的分布位置

图3 筛选与H19相关的甲基化位点

图4 转染H19后细胞中BMP2的表达量

图5 免疫染色质共沉淀测定P53的含量

图6 主动脉瓣钙化疾病中H19的作用机制

        通过以上研究，Fayez发现了lncRNA在主动脉瓣钙化患者中含量高，且H19启动子区域的低甲基化与H19的表达呈负相关。H19的敲除实验和过表达实验都说明了H19可通过改变NOTCH1诱导细胞钙化。而启动子区域的分析则说明H19通过阻止P35到启动子区域的结合抑制NOTCH1途径。在细胞中敲除H19基因会导致NOTHC1的高表达，RUNX2和BMP2的低表达，后者是被NOTHC1抑制的下游基因。

相信以上的案例将为小伙伴做类似研究提供一定的灵感~

担心自己想做的方向已经有人做了？想参考别人的研究？等等~

不要担心！！！小编还要给大家介绍今年新鲜出炉的数据库！！！

Lnc2Meth

   http://www.bio-bigdata.com/Lnc2Meth/

       该数据库基于不同疾病样本或者细胞的MCIp-seq ，ChIRP-seq以及DNA甲基化芯片等数据分析，结合pubmed已发表的文章，可以完成一键查询lncRNA参与的DNA甲基化行为[3]。

① 点击“Curation”查询已有成果，而点击“Search”便可以查询预测的结果，可以“疾病”或者“转录本名称”为关键词查询；

② 如果我们以“H19”转录本去查询已有成果，可看到H19参与的甲基化行为，而且可以导出为“excel”；

③ 如果我们查询“EGFR-AS1”或者“肝细胞癌相关lncRNA”可能的甲基化调控模式，设置“Search”中的关键词。

      好啦，这个数据库真的超级赞啊，方便了大家以后在这方面的研究，更多的功能还有待大家多多挖掘~

参考文献

[1] Chinnusamy V, Zhu J K.  RNA-directed DNA methylation and demethylation in plants. Science in China Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 2009, 52: 331-343.

[2] Hadji F, Boulanger M C, Guay S (2016). Altered DNA Methylation of Long Non-coding RNA H19 in Calcific Aortic Valve Disease Promotes Mineralization by Silencing NOTCH1. Circulation. 134. CIRCULATIONAHA.116.023116.10.1161/CIRCULATIONAHA.116.023116.

[3] Zhi H, Li X, Wang P, et al. Lnc2Meth: a manually curated database of regulatory relationships between long non-coding RNAs and DNA methylation associated with human disease [J]. Nucleic Acids Research, 2017.