文章来源:《介入放射学杂志》,2023,32：875-880
作者：朱虹颖， 王建波
外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）一般是指外周动脉，特别是下肢动脉进行性狭窄和阻塞，影响周围组织供血，糖尿病、高血压是PAD的主要影响因素［1- 3］。为解决这种血管狭窄及闭塞，以球囊扩张和支架植入为主的血管介入是常见的治疗手段［4- 5］。但介入治疗后，通常会带来血管内再狭窄的问题。Tsujimura等［6］的研究显示，453例股腘部病变患者植入InnovaTM自膨胀镍钛诺支架后再狭窄率为36％。再狭窄影响血运重建，并可导致不良血管事件发生［7- 8］。血管损伤后的新内膜增生是引起支架内再狭窄（in- stent restenosis，ISR）的原因之一［9- 11］。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）在机械损伤和炎症的刺激下由收缩型向分泌型分化，成为引起内膜增生的主要成分，导致再狭窄。大量外基质成分及细胞因子，如血小板源性生长因子（platelet derived growth factor， PDGF）的合成分泌，促进VSMC增殖并向内迁移；同时，炎症细胞，如单核细胞和巨噬细胞粘附并渗入损伤血管壁，刺激细胞外基质重塑，进一步促进内膜增生［12- 14］。因此，抑制VSMC过度增殖和迁移有助于预防内膜增生和再狭窄。基于数据分析工具对相关数据进行挖掘是探索相关疾病关键基因的一种重要手段。通过微阵列技术，监测再狭窄与健康对照之间全基因组表达，鉴定可能参与这种复杂病理状况的上调和下调基因簇，从而得到不同亚组之间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）［15］。加权基因共表达网络分析（weighted gene co- expression
network analysis，WGCNA）是一种拓扑网络分析，可以建立基因模块与临床性状之间的联系，用于后续的分析和实验［16］。遗传因素是ISR发展过程中的一个重要因素，基于基因表达综合公共数据库（gene expression omnibus，GEO），采用生物信息学分析方法探索ISR差异表达基因，有望为ISR的发病机制及治疗提供一种新思路。A7r5细胞（大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞）购自中国科学院细胞资源数据库（上海），10％血清（Gibco，美国）的DMEM培养基，于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养。GSE46560数据集从GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中获取。基于GPL15207平台，对冠状动脉内支架再狭窄的全血基因表达谱进行分析。应用R语言对原始数据进行基因注释，并使用affy包进行校准归一化处理。通过R语言中的limma包识别GSE46560数据集中ISR患者和对照组之间的DEG，设置筛选条件为P＜0.05，且|log2FC|＞1。ggplot2包用于绘制DEG的火山图，Pheatmap包用于构建DEG的热图。上调和下调的基因在数据集中按log2FC排序。通过veen图鉴定WGCNA和DEG的共同基因（https：//www.omicstudio.cn/tool）。利用R语言WGCNA包构建基因共表达网络，分析基因网络与生物性状的相关性。使用Hclust函数去除GSE46560数据集中的异常值，根据选择的软阈值修改相邻矩阵，得到拓扑重叠矩阵（topological overlap matrix，TOM）及其相异度度量（1- TOM）。以150为模块最小基因数，生成模块识别的层次聚类树。计算模块特征基因以及模块特征基因与临床特征的相关性，得到各模块的表达谱，绘制热图以可视化。利用Pearson相关系数和各模块特征基因与疾病性状P值，进一步确定模块与ISR之间的相关性。将基因表达谱与模块特征基因（module eigengenes，Mes）的相关性定义为模块成员（module membership，MM），并将外部特征与基因表达谱之间的相关性（绝对值）定义为基因显著性（gene
significance，GS），对具有最高MM值和最高GS值的基因进一步分析。GO功能分析包括细胞成分（cellular
component，CC），分子功能（molecular function，MF），生物途径（biological process，BP）。KEGG通路富集分析用于系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能。将GSE46560中DEG与蓝色模块交集基因提交至NetworkAnalyst3.0［17］，分析其生物学意义及途径，并进行可视化（https：//www.bioinformatics.com.cn）。1.6蛋白质- 蛋白质相互作用（PPI）网络构建和枢纽基因鉴定PPI网络作为生物信息学的主要方法，可以综合分析生物体内多种蛋白质的关系和功能。使用string数据库（STRING，version
11.5，http：//string- db.org/），设置最低交互分数为0.400，对DEG与WGCNA交互数据预测PPI网络，并通过Cytoscape软件对其进行优化。CytoHubba是Cytoscape的一个插件，选择5种算法（MCC、EPC、Closeness、Betweenness、BottleNeck）对每个节点基因进行评分，每种算法的前10个枢纽基因用于选枢纽基因。MCODE插件用于基因网络聚类分析，以映射关键模块，选择得分最高的一组，识别重要相互作用基因。将VSMC在6孔板中培养至80％汇合，饥饿24 h后，用PDGF-
BB处理。处理24 h后，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白质浓度测定试剂盒（Beyotime生物技术研究所，上海）测定蛋白质浓度。通过SDS- PAGE电泳分离总蛋白，转印至PVDF膜，用5％的脱脂奶粉封闭1 h。孵育ITPK1、MCM2、RAD52（1∶1 000，Abclonal）、GAPDH（1∶20
000，Proteintech）4℃过夜，TBST清洗后，室温下孵育二抗（1∶1 000，Beyotime，Rabbit）1 h。使用高敏型化学发光素试剂盒可视化蛋白条带。运用R中的limma包对GSE46560数据集进行分析，在GSE46560中筛选出了243个DEG（P＜0.05，|log2FC|＞1），其中包括109个表达上调基因，134个表达下调基因。DEG的结果可视化为火山图（图1①），前100个DEG显示在热图中（图1②）。对GSE46560数据集数据进行标准化处理后进行样本聚类分析，无异常值。当R2＞0.8时，软阈值选择为13（图2①）。设置最小模块为150时，通过平均层次聚类和动态树裁剪构建了12个基因共表达模块。grey模块代表未分类在其他模块中的基因，blue模块与ISR具有高度相关性（r=0.63，P=0.039）（图2③）。通过检查基因模块与临床特征之间的相关性，确定了与ISR最相关的基因模块。将获得的DEG基因与blue模块的基因取交集，鉴定出108个差异基因（图2④）。图3①显示了蓝色模块的散点图，表明WGCNA蓝色模块的基因与再狭窄呈现出显著相关性（cor=0.37，P=6.8e-
96），以MM＞0.85，GS＞0.85为筛选标准，筛选蓝色模块中性状模块基因。与DEG基因交互后，得到ITPK1重叠基因。选择400个基因绘制网络热图（图3②），颜色深浅显示模块基因之间相互作用程度。对颜色模块进行聚类分析，brown、green、yellow、blue、greenyellow模块之间具有强相关性，再狭窄与这些模块之间均显示出相关性（图3③）。通过NetworkAnalyst对108个基因进行功能富集分析。其生物学过程主要与蛋白磷酸化、细胞周期停滞、伤口愈合、信号转导负调节、细胞增殖等有关。对于细胞成分，DEG主要富集于核质、转录因子复合物、细胞器腔、胞质等。分子功能分析发现，前10条包括5个蛋白质相关条目（图4①）。进一步KEGG通路分析显示，交集基因在细胞周期、细胞衰老、HTLV- I感染、TGF- β信号通路以及Fcε RI信号通路等显著富集（图4②）。通过string数据库在重叠的108个基因之间构建PPI网络，将独立于相互作用网络的蛋白质删除，保留与其他蛋白质存在更多相互作用的蛋白，使用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化（图5①）。在CytoHubba中，使用5种算法MCC、EPC、Closeness、Betweenness、BottleNeck识别PPI中的hub基因，选择每种算法排序的前10个基因进行交互测试，得到4个hub基因（MCM2、RAD52、APOA1、CARM1）（图5②）。基于交互对数和交互强度，使用MCODE进行聚类以构建子网络。MCODE得分最高的中心基因与CytoHubba筛选出的基因相交产生2个关键基因：MCM2、RAD52（图5③）。ITPK1在蓝色模块中与再狭窄性状高度相关，且与此模块显著相关。MCM2、RAD52在GSE46560中上调，ITPK1显示为下调。为确认这3个基因的表达水平，用PDGF- BB处理VSMC后，提取总蛋白结果显示，ITPK1、MCM2和RAD52基因与预测结果一致（图6）。这3个基因的异常表达可能与ISR的发病机制和进展相关。血管损伤后引起的内膜增生是血管再狭窄的原因之一，其中涉及到炎症、局部血栓的形成以及血管重塑等。由于血管损伤后产生大量PDGF及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth
factor，VEGF）等生长因子，促进VSMC增殖。因此，实验中选择PDGF- BB作为建立细胞模型激动剂。Wang等［9］研究的一种外层含有VEGF质粒，内层为紫杉醇的纳米颗粒支架，通过顺序释放VEGF基因和紫杉醇，不仅抑制VSMC增殖，也促进早期内皮愈合，抑制ISR产生。表明通过标志基因表达可以在分子水平预防再狭窄。本研究中，在ISR患者和健康对照组之间筛选出243个差异表达基因，其中包括109个上调基因和134个下调基因。随后，WGCNA显示蓝色模块与ISR的分子机制有关。在蓝色模块的2 935个基因中，108个基因为与DEG的交集基因。进一步设置MM＞0.85，GS＞0.85，筛选出ITPK1基因。研究发现，ITPK1在神经管发育中起作用，与神经管缺陷有关，可在哺乳动物中形成更高磷酸化形式肌醇（IP6）的限速酶［18- 19］。其产生的高度磷酸化的肌醇磷酸盐对于MLKL介导的坏死性凋亡起重要作用；此外，ITPK1通过干扰TNFRSF1A相关死亡结构域的激活来修饰TNF- α诱导的细胞凋亡［20- 21］。ITPK1的乙酰化降低其酶活性和蛋白质稳定性，并抑制肌醇信号通路中较高磷酸化形式的肌醇多磷酸盐的合成，这种乙酰化可以被哺乳动物SIRT1逆转［22］。SIRT1与VSMC增殖密切相关。肌醇磷酸途径中IP4调节质膜Ca2+- Cl- 通道，而Ca2+通道是控制动脉张力和病理血管重塑的重要膜蛋白，与动脉粥样硬化斑块和再狭窄有关［23- 25］。GO富集显示，基因富集于蛋白磷酸化、细胞周期调节和细胞增殖。这些基因的KEGG分析主要是细胞周期、细胞衰老、胰腺癌、HTLV- I感染和TGF- β信号通路。在Cytoscape中，获得2个枢纽基因，即MCM2、RAD52。既往研究表明，MCM2、RAD52参与DNA复制和修复。MCM2是DNA复制起始的关键调节因子，随着细胞周期进展，MCM与Cdc45、GINS形成CMG复合物，招募复制相关因子如PCNA和DNA聚合酶，以启动DNA复制［26-
27］。RAD52参与双股断裂修复。通过促进互补单链DNA的退火和刺激RAD51重组酶，在基因重组和DNA修复中起核心作用［28］。Bang等［29］的研究显示，上调的RAD52通过抑制碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth
factor，bFGF），诱导内皮细胞增殖、迁移，从而影响血管生成。本研究表明，MCM2、RAD52可能参与ISR的发生和发展，MCM2、RAD52可能通过影响DNA复制，引起细胞过度增殖，最终导致ISR发生。通过对ISR患者数据集进行分析，能够更好地识别候选生物标志物和治疗靶点，有助于全面地了解ISR。使用蛋白质免疫印迹实验验证，获得了与生物信息学分析一致的结果。然而，本实验仍有一些不足，仅使用A7r5大鼠胸主动脉细胞作了初步的验证，尚未在动物水平进行相应验证；此外，大鼠源细胞验证不能完全代表人体情况，且ITPK1、MCM2和RAD52具体作用机制仍有待进一步探索。
综上所述，通过整合DEG和WGCNA的结果，筛选出3个基因：ITPK1、MCM2和RAD52。这些基因在细胞增殖、细胞周期途径中显著富集。蛋白质免疫印迹实验验证，ITPK1、MCM2和RAD52可能是ISR发生发展的关键基因。
［参 考 文 献］（略）
（收稿日期：2023- 01- 30）
（本文编辑：新 宇）
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