2017年肿瘤精准医学界最耀眼的明星无疑是免疫治疗。刚刚闭幕的中国临床肿瘤学会（CSCO）学术年会上，专题报告中有15.6%的主题是肿瘤免疫治疗，超过靶向治疗和化疗的热度。亲临现场的您一定注意到，肿瘤免疫治疗领域的专家学者都在幻灯片里展示过下面这张“肿瘤免疫周期”图（图1）。今天，我就来介绍这张图里阐释的细胞生物学机制和相关的临床免疫治疗手段，帮助您从全局角度重新认识肿瘤免疫治疗。
图1. Daniel Chen和Ira Mellman于2013年在Immunity杂志上发表的肿瘤免疫周期图
本期文章是肿瘤免疫治疗三部曲的第一篇，三部曲将依次介绍：
1）肿瘤免疫周期和相关临床药物
2）肿瘤异质性和微环境分析技术
3）肿瘤免疫检查点和CAR-T技术
后两篇将分别于10月底和11月中于基因智慧发表，敬请期待！
早在十年前，免疫学家在实验室中已经证明免疫系统能够识别并消灭肿瘤细胞，但在临床转化时（如细胞因子和肿瘤疫苗疗法等）响应率普遍非常低，使得学术界并不看好肿瘤免疫治疗的前景 。甚至2007年Schering收购Organon后，对其研发管线中的 pembro项目（两年后随Schering一起被默沙东收购，现已成为王牌免疫治疗药Keytruda）也束之高阁。3年后，Dendreon研发的首款肿瘤治疗疫苗Provenge获FDA批准用于治疗前列腺癌。紧随其后，施贵宝的CTLA-4抑制剂ipilimumab在2011年获FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤，其研究管线中的PD-1抑制剂nivolumab也开始受到业内关注 。同年的诺贝尔生理学和医学奖也被授予三位研究免疫学机制的科学家。终于，主流学术界开始认同肿瘤免疫治疗的方向，相关的研究也很快呈现出爆炸式的增长。
Genentech的两位资深肿瘤免疫学专家 Ira Mellman和Daniel Chen（图2）意识到肿瘤免疫学作为一门新兴的交叉学科，正在被不断涌现的新知识和生物体的复杂性所困扰，于是决定画一张简洁又有逻辑的肿瘤免疫学全景图，让各种复杂又松散的细胞生物过程统一起来。不久之后，Genentech的艺术家根据两位科学家在餐巾纸上画的原型图设计出一幅由七个圆和箭头构成的闭环图 。这张图很快传播开成为研究肿瘤免疫学的思维框架，并于2013年在题为《Oncology Meets Immunology: The Cancer-Immunity Cycle》的文献回顾中首次发表。
图2. Daniel Chen（左）与Ira Mellman（右）在日常讨论（图片来自Genentech官网）
2013版的原图中，Mellman和Chen将免疫系统消灭肿瘤细胞的过程分为七个步骤，与特异性免疫类似：
1）肿瘤细胞死亡并释放肿瘤特异抗原；
2）抗原呈递细胞摄取并处理肿瘤新抗原；
3）抗原呈递细胞进入淋巴结激活T细胞；
4）激活的T细胞离开淋巴结进入循环系统；
5）T细胞穿过血管壁浸润到肿瘤微环境；
6）T细胞通过特异性受体识别肿瘤细胞；
7）肿瘤细胞被T细胞识别并溶解消灭；
这七个步骤构成一个闭环，各种可能影响肿瘤免疫周期的治疗手段都可以被映射到这张图上（图3）。即使4年后的今天来看，这张肿瘤免疫治疗的蓝图依旧清晰。
图3. 可能影响肿瘤免疫周期的治疗手段（2013年版的原始图）
下面我将介绍肿瘤免疫周期的七个步骤中主要的细胞生物学机制：
1
肿瘤细胞死亡并释放肿瘤特异抗原
基因组突变是肿瘤免疫过程发生的驱动因素。肿瘤细胞的基因编码区变异或整合进染色体内的病毒DNA会都会产生导致表达出特殊的蛋白质。这些蛋白质碎片可以被T细胞识别为“外源”肽， 所谓的“新抗原”（neoantigens）。当肿瘤细胞因各种原因死亡后，含有新抗原的蛋白质被释放到细胞间质中，等待被抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APCs）摄取。
各种临床治疗手段，如放疗、化疗、靶向治疗和溶瘤病毒，都因为能够杀死肿瘤细胞并激发由肿瘤新抗原引起的免疫反应，而被Mellman和Chen标注在肿瘤免疫周期的第一步。今年CSCO会议上，华西医院的卢铀教授带来了专题报告《放射治疗与免疫效应机制》，介绍的就是放疗后出现远端病灶缓解的现象与免疫效应机制的关系。
2
抗原呈递细胞摄取并处理肿瘤新抗原
专业的抗原呈递细胞树突状细胞通过巨胞饮（micropinocytosis）捕获细胞间质中的死亡肿瘤细胞释放的蛋白质，并水解为可以结合到MHC 抗原呈递复合体上的肽段。该过程也可由一般的抗原呈递细胞，如巨噬细胞完成。
MHC复合体分为I型和II型。 I型复合体广泛表达于体细胞中，它呈递系统能够T被T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别。而II型复合体（图4）主要表达于树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞中，是更专用的抗原呈递系统。部分树突状细胞在向T细胞呈递新抗原之前，能够先从MHC II型呈递系统向MHC I型呈递系统进行一次交叉呈递（cross presentation），相关机制不清晰。相较于MHC I型，II型对与之结合的肽段的长度没有严格的限制，这样可以尽可能多地容纳外源肽段。
图4. MHC II型抗原呈递系统示意图
长期肿瘤抗原刺激会引起免疫系统的耐受性，这样避免激活的免疫细胞攻击正常细胞。抗原呈递细胞需要有包括促炎症细胞因子和肿瘤细胞死亡时释放的因子在内的多种免疫原性信号（immunogenic signals）共同作用，否则将无法有效激活能够识别呈递的特异性抗原的T细胞。
2010年，FDA批准的首个前列腺癌细胞免疫疗法Provenge（Sipuleucel-T）就是一种提升抗原呈递效率的治疗性疫苗。该疗法通过提取患者的树突状细胞，与融合抗原蛋白PAP-GM-CSF（PAP，一种在前列腺癌中过表达的酶，GM-CSF，促进树突状细胞成熟的信号）混合进行体外培养后回输，帮助前列腺癌患者的免疫系统完成对PAP的抗原呈递。
今年夏天，美、德两国的研究团队在Nature杂志分别发表文章，报道各自运用个体化治疗疫苗治疗黑色素瘤的临床疗效数据（图5）。与Provenge选择固定的肿瘤抗原策略不同，最新的个体化疫苗首先通过生信分析和体外实验发现某位患者的肿瘤细胞可能呈递的新抗原组合（本系列的第二篇文章将详细介绍抗原呈递的预测技术），再合成抗原蛋白质（美国Catherine Wu的团队）或携带抗原编码的mRNA（德国Ugur Sahin的团队），最后将合成的蛋白或mRNA注射到患者体内，加速完成对一组肿瘤抗原的呈递过程。
图5. 德国BioNTech团队公布的参与mRNA疫苗的黑色素瘤患者的治疗史
3
抗原呈递细胞进入淋巴结激活T细胞
未成熟的树突状细胞被载有新抗原的MHC复合体激活并通过淋巴系统移往区域淋巴结，到达淋巴结时树突状细胞已成熟，并表达出激活初始T细胞所必需的共刺激分子（图6）。淋巴结中的部分初始T细胞表达能够识别肿瘤新抗原的T细胞受体这些受体可以与到达淋巴结的树突状细胞表面载有新抗原的MHC 复合体结合，并在共刺激分子的协同作用下诱导T细胞增殖并分化成为效应T细胞（effector T cells）和调节性T细胞（T regulatory cells）。激活初始T细胞基本上是所有特异性免疫必需的一步，免疫反应的性质和平衡也在这一步通过效应T细胞（激活免疫杀伤）和调节性T细胞（抑制免疫杀伤）的比例来精确控制。
图6. 肿瘤新抗原载入 MHC复合体后，树突状细胞成熟并转移至淋巴结去激活T细胞
初始T细胞被激活后开始分泌细胞生长因子IL-2并对其响应，同时T细胞表面表达与IL-2结合更紧密的IL-2受体蛋白α链，加强IL-2信号引起的细胞周期加速。免疫系统通过这种自分泌（autocrine）调节强化T细胞增殖和分化（图7）。除了正向反馈机制，激活的T细胞也会提高CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CD152）的表达量，通过与CD28竞争结合B7来抑制T细胞的增殖，起到平衡作用（图8）。很多情况下初始CD8 T细胞结合共刺激因子不足的抗原呈递细胞时，需要CD4 效应 T细胞辅助提升抗原呈递细胞共刺激因子的表达和旁泌性（paracrine）地分泌IL-2（图9）。目前，FDA已经批准重组IL-2（如aldesleukin）和CTLA-4单抗（如ipilimumab）用于抗肿瘤治疗。
图7. 以初始T细胞分化为CD8 细胞毒性T细胞的过程为例，初始T细胞被激活后开始分泌细胞生长因子IL-2并通过提高对IL-2的响应能力来完成快速增殖
图8. 载有肿瘤新抗原的MHC复合体和共刺激因子协同作用激活T细胞并诱导其分化成熟，T细胞激活后提高与B7结合力更强的CTLA-4来抑制过度增殖
图9. 共刺激因子不足时，初始CD8 T细胞结合需要CD4 效应 T细胞辅助
4
激活的T细胞离开淋巴结进入循环系统
初始T细胞在未激活前周而复始地在血液系统和淋巴系统中循环穿梭，尽可能提高初始T细胞能够与载有匹配的抗原呈递细胞的结合机率。只有激活的T细胞会停留在淋巴结数天进行增值和分化，否则停留数小时后未被激活的T细胞将重新回到血液循环中（图10）。在初始T细胞分化为效应T细胞的过程中，T细胞表达的细胞黏附分子（cell adhesion molecules）组分也会变化，促进激活的T细胞离开淋巴结并在血液循环中定位到发生炎症反应区域的血管壁（图11）。
图10. 部分进入淋巴结的T细胞被树突状细胞激活并分化，在淋巴结内T细胞区（T-cell zone）停留数日到一定数量后在经输出淋巴管（efferent lymphatics）离开淋巴结进入血液循环系统
图11. 以效应CD4 T细胞为例，从初始状态向激活状态的分化过程中，T细胞表达的黏附分子组成发生改变，以促进成熟的T细胞离开淋巴结进入血液循环
5
T细胞穿过血管壁浸润到肿瘤微环境
T细胞流经未发生炎症反应区域内血管时只能与血管内皮细胞发生可逆的微弱结合，不足以帮助T细胞在血流冲击下锚定。但当肿瘤引起局部免疫反应后，周围组织会像炎症反应一样释放细胞因子和趋化因子。T细胞表面的特异性受体接收到趋化因子信号后，会激活整合素（integrins）与血管内皮细胞强力结合。与此同时，炎症反应释放的细胞因子也会提升血管内皮细胞中附着蛋白的表达量，进一步增强与T细胞整合素的结合，以锚定并辅助T细胞环浸润到肿瘤微环境中（图12）。
图12. T细胞与血管内皮细胞锚定，渗出并浸润到趋化因子引导的方向
6
T细胞通过特异性受体识别肿瘤细胞
前面介绍过，肿瘤在增殖和演化过程中不断积累的突变将产生能够被T细胞特异性识别的新抗原，这被认为是肿瘤免疫过程的驱动因素。肿瘤细胞和一般体细胞一样，在核糖体生产蛋白的过程中会产生一定比例有缺陷的蛋白质（defective ribosomal products, DRiPs），这些蛋白会在胞浆中被水解为肽段并被转运到内质网，能够稳定地与MHC I型呈递复合体结合的潜在抗原会被呈递到细胞膜表面，等待被 T细胞检查（图13）。本系列的第二篇文章将详细介绍抗原呈递的预测技术。
图13. MHC I型抗原呈递系统示意图
目前已在部分结肠癌、前列腺癌和宫颈癌患者体内发现失去MHC I型复合体的肿瘤细胞，这样的肿瘤细胞可能无法被CD8 细胞毒性T细胞识别并溶解。但小鼠实验数据显示，MHC I型复合体缺失的肿瘤组织也可以被部分清除，这被怀疑是自然杀伤细胞（natural killer cells）的作用结果。
在组织中的CD8 细胞毒性 T细胞首先通过整合素结合体细胞。如果在短时间内没有发现载有抗原的MHC I型复合体，T细胞将释放该体细胞并转移到下一个潜在目标。T细胞一旦在巡弋过程中通过T细胞受体特异性识别出某个体细胞表面存在肿瘤新抗原，T细胞受体将传递信号以增强T细胞与体细胞的结合，准备对目标细胞进行杀伤（图14）。
图14. 细胞毒性T细胞在逐个识别体细胞表面是否有特异性抗原
全球首例被FDA批准的CAR-T细胞药物Kymriah（tisagenlecleucel-T），就是借助生物工程技术绕过了抗原呈递过程，直接赋予患者自身的T细胞识别特定抗原的能力。与临床上正在使用的单抗靶药相比，CAR-T细胞药物有三个特点：1）锁定靶点标记的肿瘤细胞并直接清除；2）通过释放细胞因子增产对肿瘤细胞的免疫攻击；3）CAR-T细胞药物可以不断增殖。因为人工干预大幅提升免疫系统的攻击性，Kymriah 在临床治疗中常见的副作用就是细胞因子释放过量，所以FDA批准Kymriah的同一天也扩大了IL-6R抗体（tocilizumab）的适应症用于治疗CAR-T治疗中出现的细胞因子释放综合症（cytokine release syndrome）。
CAR-T治疗需要预先设计嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）。血液细胞表面有较为明确的标记蛋白，所以早期的CAR-T细胞药物都被设计专门治疗血液肿瘤。去年12月，《新英格兰医学杂志》报道过一项靶向实体瘤CAR-T治疗的成功案例。一位50岁的多灶型胶质母细胞瘤患者在接受10次靶向IL13Rα2（脑瘤中的一种常见受体）的CAR-T细胞药物注射后，影像学上看到患者的部分病灶消失，部分病灶显著缩小。找到合适的肿瘤特异性抗原仅仅是实体瘤CAR-T治疗的第一步，因为实体瘤的微环境十分复杂。T细胞有时无法趋向因子的引导下浸润到肿瘤病灶处，成功浸润的T细胞可能还需面对缺乏营养和免疫抑制性等挑战，这些因素都会限制实体瘤CAR-T的疗效。据悉，我国上海细胞治疗中心正在研发和实验新一代CAR-T疗法，通过分析免疫微环境的异质性和灵活运用免疫干预技术，期望实现反应率和疗效出色的实体瘤细胞治疗技术。
7
肿瘤细胞被T细胞识别并溶解消灭
当细胞毒性T细胞识别出肿瘤细胞表面的特异性抗原后，胞浆内储存的效应分子将朝目标方向释放，在不影响周围正常细胞的情况下溶解肿瘤细胞（图15）。T细胞受体与抗原的结合从三个方面控制细胞毒性T细胞的杀伤效应：1）增强T细胞与目标细胞的结合；2）定位效应分子分泌结构的朝向；2）触发效应分子的合成和释放。 细胞毒性T细胞的主要杀伤效应分子包括穿孔素（perforin）、颗粒酶（granzyme）、颗粒溶解素（granulysin）等。
图15. 识别到肿瘤抗原后会极化细胞毒性T细胞并将效应分子聚集在目标细胞侧
被溶解的肿瘤细胞会释放各种合成的蛋白质到细胞间质中，至此肿瘤免疫完成一个闭环周期 。人体各个部位的免疫环境基准状态差异很大。一般来说，极其重要的器官或微生物群落复杂的部位能够通过细胞隔绝或在局部微环境中抑制免疫活性来一定程度上享有免疫豁免（immunity privilege）。实体瘤细胞也会模仿免疫豁免状态以防御浸润到肿瘤微环境的T细胞，手段包括表达免疫抑制分子和分泌结构蛋白（图16）。本系列的第二篇文章《肿瘤异质性和微环境分析技术》将具体介绍肿瘤免疫逃逸（tumor immune escape）机制。
图16. 具有免疫原性的实体瘤癌细胞可以模拟免疫豁免的方式防御T细胞的杀伤
PD-1（programmed death-1）与CTLA-4（调节T细胞的激活过程，前文已述）都是T细胞表面表达的抑制性受体。PD-1用于调节已经激活的T细胞的活性来避免引起自身免疫疾病（autoimmune diseases），一般在激活的T细胞中被瞬时诱导表达。促炎症因子（pro-inflammatory cytokines）的信号作用可以抑制T细胞的PD-1表达，提高T细胞杀伤作用；在慢性感染中PD-1被发现广泛表达，钝化了T细胞的杀伤效应。PD-L1 和PD-L2作为免疫检查点PD-1的抑制性配体，通过与PD-1结合来抑制T细胞增殖和T细胞受体的下游信号，也可以诱导T细胞凋亡。正常情况下，PD-L1会在多种细胞中组成性表达（constitutively expressed），炎症反应会提升PD-L1的表达量，而PD-L2主要表达于免疫细胞。 已发现多种肿瘤中都存在PD-L1高表达的现象，降低了这些肿瘤细胞对T细胞杀伤的敏感性。跨国药企开发了多种靶向CLTA-4或PD-1/PD-L1的单抗类药物，并获得FDA批准用于抗肿瘤治疗。国内医药界对免疫检查点药物的研究和开发上也势头正劲，本系列的第三篇讲系统介绍肿瘤免疫检查点和CAR-T技术。
IDO（indoleamine 2,3-dioxygenase）是犬尿氨酸途径（Kynurenine pathway，色氨酸代谢到NAD途径的旁路）的胞内限速酶，可以通过耗竭微环境中的色氨酸并产生犬尿氨酸（免疫抑制性代谢物）调节T细胞的活性，维持出现炎症后的免疫反应与免疫耐受之间的平衡。肺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌在内的等多种癌症组织中都发现IDO过表达的现象。过度活跃的IDO会促使树突状细胞直接抑制T细胞活性，产生免疫抑制性的肿瘤微环境，使T细胞浸润到肿瘤组织后很快失活。目前，可以抑制IDO1酶活性的小分子药物epacadostat已经进入治疗黑色素瘤的三期临床试验阶段，其与PD-1单抗药物pembrolizumab的联合治疗临床试验也在积极进行中。已公布的数据显示，联合IDO抑制剂可以将pembrolizumab的治疗效果翻倍，同时不良反应发生率降低。就在一个月前， 中科院上海有机所以4.57亿美元的价格向信达生物授权一项IDO抑制剂的独家开发权。
上面已经介绍完肿瘤免疫周期的七个步骤。我也制作了一张简图来概括临床肿瘤免疫疗法和肿瘤免疫周期的关系（图17）。总结一下，肿瘤免疫过程中需要抗原呈递细胞识别肿瘤抗原并激活免疫系统，效应细胞增殖并转移到肿瘤病灶进行特异性杀伤，最终抑制效应细胞的免疫活性以避免自身免疫。在实际临床治疗中，研究人员需要系统性地评估免疫疗法对免疫系统与肿瘤微环境之间的动态平衡造成何种影响。肿瘤个性化治疗疫苗带来的人为干预较小，主要依赖人体本身的免疫细胞，但需要强大的生物信息处理能力；过继细胞治疗通过向患者直接输入免疫细胞，可以快速达到杀伤效果，但对细胞改造提出了很高的要求；免疫检查点药物目前商业化最好，小分子和单抗类的药物属性也易于临床推广，但有效的前提是患者体内已经存在能够杀伤肿瘤的淋巴细胞。
图17. 肿瘤免疫疗法与肿瘤免疫周期间的概念性关系
今年1月，Mellman和Chen 在Nature杂志上发表最新文章《Elements of cancer immunity and the cancer–immune set point》，提出在肿瘤免疫周期的基础上将肿瘤组织的免疫表型分成三类（图18）：
1）免疫阻隔型（immune-excluded tumor）
2）免疫荒漠型（immune-desert tumor）
3）免疫炎症型（inflamed tumor）
图18. 影响肿瘤免疫设定点（the cancer-immune set point）的因素
在这份最新的肿瘤免疫设定点框架下，除了宿主遗传因素和肿瘤自身特点外，治疗手段、环境因素和微生物群落都被纳入考虑范畴中。有兴趣的读者可以阅读这篇综述，紧跟学术界对肿瘤免疫学的最新认识。相信随着科学技术的进步，人类对免疫系统的复杂性会了解得更清晰具体，据此发展的免疫治疗手段也必定更先进有效！
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