导语
通过上一期的学习,我们已经知道,在生物医药行业,鼠是最常用的模式动物。特别是,近年来,随着基因编辑技术的飞速发展,利用基因修饰的大小鼠进行人类疾病的前沿研究也取得了重大的成果。
ES 细胞基因打靶技术是获取基因编辑小鼠的传统方法,这一技术起源于上世纪 80 年代, 1987 年,Thompsson 等首次利用 ES 细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 (hprt) 基因敲除的小鼠模型,此后这项技术获得了长足发展。然而,利用 ES 细胞基因打靶技术建立小鼠模型因操作繁琐复杂、耗时长、人力物力成本高,限制了这一技术的广泛应用。ZFN、TALEN 以及 CRISPR/Cas9 等新兴基因编辑技术的出现和发展颠覆了遗传工程动物模型的构建方式,甚至有可能重新定义哪些物种可作为模式生物。
尤其是利用最新的 CRISPR 技术科学家现在可以在短短 3-4 周的时间内构建出携带单个甚至多个基因突变的小鼠,而采用传统的方法这需要数年的时间。并且 CRISPR/Cas9 具有操作简便,靶点选择范围广,作用活性高等优势。
图 1. CRISPR/Cas9 介导的 DNA 双链断裂及基因编辑示意图
CRISPR/Cas9 做为目前效率最好的基因编辑工具之一,我们这次就先来说说以利用 CRISPR-Cas9 是如何建立基因编辑小鼠模型的实验步骤
1.针对特定基因序列,利用软件(sgRNA Designer)预测潜在 sgRNA 序列,并依据实验要求挑选合适的靶点;
2.sgRNA 活性筛选,选出有活性且特异性高的 sgRNA;
3.构建 sgRNA 表达载体,并利用 T7 体外转录试剂盒进行 sgRNA 体外转录;
4.利用 SP6 转录试剂盒进行 Cas9 mRNA 体外转录;
5.将 Cas9 mRNA 和 sgRNA 按合适浓度混匀,并进行受精卵显微注射;
6.注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内继续发育;
7.待子代小鼠出生后对其进行基因型分析。
图 2. 利用 CRISPR/Cas9 建立基因修饰小鼠模型
sgRNA 设计与筛选
1.选择 sgRNA 靶点时应挑选特异性高的序列,以避免 off-target 效应;
2.将 sgRNA oligo 构建至 px330 载体上,同时构建含有目的基因靶序列的 luciferase 表达载体上,二者共同转染 293T 细胞;
3.转染 6 小时后补液,48 小时后收集细胞,并加入裂解液裂解细胞;
4.12,000rpm 离心 5 min,将上清液收集至洁净 EP 管中;
5.按荧光素酶试剂盒进行操作并检测。
F0 代小鼠基因型鉴定
1.取出生后 5—7 天小鼠组织,消化并提取基因组后进行 PCR,扩增目的条带;
2.将 PCR 产物进行梯度降温退火处理,加 T7E1 酶并在 37℃ 水浴酶切 30 min;
3.琼脂糖凝胶电泳,检测 PCR 产物是否能被切割为多条片段;
4.送测序分析,并保留符合要求的突变小鼠;
5.待小鼠具有生殖能力后进行交配,以获得足够数量的杂合及纯合小鼠。
注意事项:
1.体外转录的 Cas9 mRNA 和 sgRNA 要求纯度高,且在操作过程中防 RNA 降解;
2.显微注射胚胎要保证状态良好,且数量充足;
参考文献:
1.Bradley A, Evans M, Kaufman MH et al.Formation of germ-linechimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.Nature.1984.17-23;309(5965):255-6.
2.Doetschman T, Gregg RG et al.Targettedcorrection of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells.Nature. 1987,10-16;330(6148):576-8.
3.Li D, Qiu Z,Shao Y et al. Heritablegene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system.Natbiotechnol.2013;31(8):681-3.
4.Shao Y, Guan Y, Wang L et al. CRISPR/Cas-mediatedgenome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos.Natprotoc.2014;9(10):2493-5125.Yang H, Wang H et al.One-stepgeneration of mice carrying reporter and conditional alleles byCRISPR/Cas-mediated genome.Cell.2013; 154(6):1370-9.
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